干细胞培养技术篇1

细胞培养基和细胞培养工艺是生物制药和疫苗产业中最关键的部分，我国在此领域人才奇缺，在“”的呼唤下，有着近30年海外背景的罗顺回国创业，为祖国发展贡献自己的智慧。

从国际知名科研工作者，到兼具科研创新、经营管理等多重素质的综合型人才，罗顺实现了角色的成功转型，也在生物制药王国画下壮美的蓝图。

“1号”人才引进回国

美国钢铁大王卡耐基曾说过：将我所有的工厂、设备、市场、资金全部夺去，但是只要保留我的组织人员，四年之后，我仍将是一个钢铁之王。1950年，钱学森决定返回祖国时，主管他研究工作的美国海军次长大为震惊。他认为：钱学森无论在哪里都抵得上五个师。他说，我宁肯枪毙他，也不愿放他回中国。这充分说明了科技人才对一个企业乃至一个国家的重要性。不论在国外还是回国发展，罗顺都是这种不可替代的人才。

罗顺是从华中农业大学毕业后走出国门的，那是1985年，当时算是公派留学。去美国有一个明确的目的，就是希望研究生物化学的一些特性。结合大学学生物化学时研究过酶的一些特性，罗顺开始了对酶的表达情况的研究。

在美国，罗顺一鼓作气，完成俄勒冈州立大学生物化学专业硕士、弗吉尼亚理工大学分子生物学博士学位，并在哈佛大学医学院完成针对癌症的博士后研究。毕业后，因为出色的科研才华受到美国各大知名制药公司的青睐，他先后供职于瑞士制药公司、美国BeckmanCoulter公司、美国基因XP生物技术公司、美国细胞培养基公司、美国基因泰克生物制药、美国安进生物制药。在美国待了近30年，罗顺的事业和生活就像他的名字一样，顺风顺水。

2011年的中国生物制药行业，方兴未艾，面临新的发展机遇。2008年陆续回国的同事和朋友都纷纷劝他回国发展生物制药。如果继续留在美国，自己创业，基本只能是个梦想;如果回国，能为国内的生物制药贡献自己的智慧。说干就干，罗顺是一个果敢的人，当下决定回国创业。

在罗顺看来，当时的生物制药作为战略新兴产业，国家对其支持力度很大。中国是一个巨大的医药市场，生物制药是它的核心。并且随着人们对生活品质的提升，越来越关注高质量、健康的生命。尽管近年国家也引进了一批生命科学领域里高水平的专家学者，不过这些人更多是从事基础理论研究，缺少实践者。他认为，要把研究成果转换成生产力，转换成社会价值的东西，你必须要通过产业化。而这正是罗顺回国想实现的。

2011年，时任北京市委书记刘淇亲自批示，将罗顺作为国家第六批第一号人才，引进回国。

回国后，在甘肃做投资的朋友的支持下，罗顺将起点选在甘肃兰州。虽然与科技资源相对丰富的北京失之交臂，可罗顺后来发现，这里非常适合开展培养基的研究。

个中艰辛唯有自知

万事开头难。从未有过经营管理经验的罗顺，碰到了一个接着一个的棘手难题，很多都让他始料不及。

“最大的困难是人才。我带回的是美国技术专家团队，他们中大部分人不会说中文，而且很多是学者型的人才，他们有技术但是遇到问题解决不了，不适应国内的环境。”从论文成果到进入市场成为相对成熟的产品，这中间有一个对企业家和科学家来说是高风险、高投入的关键环节，而要实现这一环节的无缝链接，亟需大批既懂经营也懂科技的科技经营人才。为此，罗顺投入很大的精力来培养本土的团队。

第二个需要面对的问题，就是国内的经济环境、政治环境，以及大家对生物制药行业的误解，大家往往觉得今天投资，明天就能有回报。

“生物制药行业是一个长期投资，大量投资，慢回报的一个行业。所以，不论政府方还是投资方都会提出疑问：他们这么厉害，怎么还没赚到钱？整个社会上的反映也会是，干了两年半，怎么还没有成为世界最大的培养基公司？或者新药怎么还没有研发出来？”这一点让刚回国的罗顺颇感憋屈和无奈，“培养基不是做药的，我们是做原材料的，这是理念上需要纠正的。”

最重要的问题是，国内外都对本土公司的技术不看好，没信心。“很多人觉得，中国公司的技术绝对不如美国的公司，美国的东西一定比中国好。”罗顺说，这种心态似乎形成了一种惯性，植根于每个人的头脑中。“美国人觉得中国制药是劣质、质量不好，原材料质量更不好。我现在做生物科技技术，我也有一个理念，我做的是原材料的事，要做到跟世界一样的水平。”这是罗顺的目标。

从国家部委到地方政府，从投资方到合作方，每个人都在寄希望于罗顺，此时的他，背负多方压力，唯有埋首科研、尽心经营，用事实告诉人们，他的目标达到了。

瞄准生物制药的CPU――细胞培养基

细胞培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境，是生物医学工程中最重要的组成部分。细胞培养基市场主要由美国三大公司――美国英杰（Invitrogen/Gibco）、西格玛SAFCBio、海克隆（Hyclone/GEHealth）垄断。中国细胞培养基市场年需求量大约在600～700吨，由于目前中国并没有能够大规模生产细胞培养基的厂家，而现有的几家小型供应商的产品研发能力不足、生产技术和工艺又不成熟，所以产业化需求难以满足，中国市场上95%的培养基都需要依赖从美国进口，从而导致我国生物制药产业受困于成本高、受制于人的窘境，且如果国内研发、生产能力持续落后，发展缓慢，将长期依赖进口。

最初注意到细胞培养基，是罗顺还在美国生物制药公司的时候。当时，美国几家著名的生物制药公司都与他保持着联系，他们希望罗顺能给他们在这方面提供技术支持，或是担任顾问提供指导。朋友们就纷纷劝他，不如回国，开一个细胞培养基的公司。

“就像计算机的CPU一样，再好的计算机PC设计，如果没有CPU这个核心，生产不出好电脑。”罗顺回国后最成功的是，瞄准了生物制药的CPU――细胞培养基。

细胞培养基对生物制药的产业和行业而言，是一种关键的生产原材料，也是一项关键的生产的技术。罗顺早期的研发工作就是围绕生产的工艺开发进行的，主要是细胞代谢理论的研究、细胞培养基的开发、细胞培养工艺的开发。在对细胞代谢理论进行系统研究的基础上，罗顺建立了一个细胞代谢效率的理论，这个理论就是指导我们怎样给细胞提供最有效的营养，而这个最有效的营养组合就是细胞培养基。由他领导的CHO细胞培养课题组以其在业内一流的药用蛋白产量著称于世，创世界最高产量达每升11克，同时拥有3项专利，罗顺本人获得2010年安进科技创新最高奖。自此，他的科研实力在业界声名鹊起。

“我们把美国一流的细胞培养基技术带回来了，等于是带回来国际一流的新产品开发技术研发平台。短期内，可以研发出将近100种细胞培养基配方，这对中国的生物制药产业的意义是巨大的。”任何一个企业，凭借这项独一无二的工艺，就能涉入更多的生物制药领域，打造起核心竞争力。而对整个产业来讲，更是有着“革命”般的作用，它提高了整个产业的生产效率，发挥了榜样的作用。

打造生物科技的“黄埔军校”

如果说罗顺带回的细胞培养基技术，让我国生物制药行业摆脱了美国培养基公司对中国市场的垄断，而且能提高客户公司的生产的效率和核心竞争力。那他带回的干粉工艺流程，更是填补中国细胞培养基干粉生产的空白。

在罗顺的公司，美国CRB设计团队（曾参与编写美国GMP）首次为中国企业设计、监理、建设，并且这也是国内首家引进针磨技术的企业，生产车间采用国际一流的干粉生产设备。针磨技术解决了国内干粉培养基生产时温度、湿度、粒度稳定性等难题，取代了国内传统的球磨工艺，大大减少了培养基在研磨过程中的损耗，使得公司拥有了符合cGMP标准的工业化大规模细胞培养基生产平台，产能可达300吨/年。

在工艺开发的过程中，罗顺深刻地感受到，科学研究、成果转化和应用，人才不仅是一个非常重要的因素，而且是第一因素。甘肃健顺生物科技有限公司在成立之初就决定要培养年轻的人才队伍，因为这对公司的长期发展至关重要。

在此理念的指引下，依托“无血清细胞培养基工程实验室”，团队培养出了一批中国乃至世界的具有扎实理论基础和实践能力的生物技术人才。同时，与当地大专院校（兰州大学、甘肃农业大学、西北师范大学等）、科研院所联合培养人才，以能力培养为核心，综合素质培养为主线，培养技术型人才和高级经营管理人才，并在科学研究和产学研相结合过程中，掌握国际领先的研发设备，逐步探索出符合公司特色的培养体系。

“我们想打造一个开明、民主、自由的公司文化，也像在美国一样，很多年轻人都直呼我的名字。我们提供单身员工的宿舍，我们有食堂，食堂的伙食非常好。我们与高校联合组织篮球比赛、马拉松，给他们提供放手去做的条件，允许他们出错。”

罗顺对于人才培养可谓费尽心思。公司会对培养对象进行专业辅导培训。如：组织国外专家举办生物医药学科的科学讲座，使培养对象深入了解生物医药产业的先进理念和国际领先的技术水平;每周开设外国专家与新进人才在生物医药领域英语、汉语的专业语言交流提高课程，增强科研合作与交流的能力;鼓励和支持培养对象参加学术交流等活动，了解生物医药领域的一些最新研发动态，拓宽年轻人才的知识结构和研究视野。

在培养过程中发扬“传、帮、带”的精神。通过外国专家亲自到实验室指导实验的方式，培养他们的实验动手能力和独立开展科研的能力。在专家们规范严谨的指导下，一批年轻的科研人员已逐步掌握了试验的方法和操作的要领，并成为了我们科研团队的主力军。

同时，还会有计划地安排年轻科研人员跟随专家团队去境外培训进修，促进团队与境外、国外学者的交流，使年轻科研人才逐渐在国内外科学舞台上崭露头角，并逐步培养和成长为中国生物医药界的新生力量。

“我是希望，能打造出中国生物制药工艺开发――细胞培养基的‘黄埔军校’。”罗顺说，如果公司发展到一定程度，希望能在兰州大学或其他高校建立生物工程专业。他说，在美国，也只有为数不多的几所大学拥有这个专业。他希望能把该领域世界一流专家教授都请来讲授，这样，也能为国内这个领域培养更多人才。

携健顺生物扬帆远行

致力于“无血清个性化化学成分界定细胞培养基”及其工艺的研究开发，同时提供培养基配方委托生产、Clonepix细胞株筛选等技术支持配套服务，2011年3月，甘肃健顺生物科技有限公司（以下简称“健顺生物”）成立，罗顺是公司创始人。

“我们的最终目标就是，降低最高端的生物制药的成本，让更多的老百姓用上生物制药。”罗顺深谙生物科技的这一文化核心和理念，“我们哪怕做非常小的一件事情，也是希望为客户降低成本，用药去治病救人，我们公司的文化是植根于此的。”

目前，健顺生物的产品主要应用于生物制药（治疗性重组蛋白，包括单克隆抗体）、细胞治疗以及人/兽用疫苗的工艺开发与生产。

“健顺生物与美国领先细胞培养基公司一样，拥有世界一流的干粉生产线设备技术、工艺流程，年产量可达300吨，这是国内公司所不具备的。最重要的是，与欧美生物制药公司一样，拥有一流的高等生物细胞培养基配方开发基础理论与技术平台，就连美国三大培养基公司都不具备。”健顺生物独具优势的竞争力让他们初战告捷。

公司成立3年来，在罗顺的带领下，凭借自身全球领先的研发技术水平和过硬的产品质量，目前已产生强大的市场价值，已与兰州、成都、上海、广州、山东、北京、武汉、石家庄、浙江、等十多个省市地区超过35家生物药企建立业务联系，与30多家药企已签订了合作协议，并签订了工艺开发技术项目10多项。同时已与上海、成都等多家大型药企签订了培养基长期供应合同，完成了从一开始的10L、100L的小规模供应到现在10000升以上的批量供应的产业化规模，其中国内创新药开发领军（上市）企业康弘药业等多家知名药企已将我公司细胞培养基列入其新药临床申报，将健顺生物细胞培养基确定为其新药的唯一指定原材料供应商。同时，健顺生物与具有全球竞争创新能力的生物医药公司展开合作，签订了10年的委托供应研发协议。

当然，罗顺对公司未来的定位绝不止于此，在他看来，“这不只是一家以技术服务为主的企业和一支成熟的世界领先的技术团队，更重要的是以技术力量所带来的客观周边效应。公司落户兰州，希望能对甘肃生物制药行业的发展产生积极的影响，使甘肃省的高新技术产业园区在全国乃至全世界立于领先地位。”

为中国生物制药行业提供世界一流的细胞培养基与研发服务！力争在细胞培养基领域成为世界一流的技术与产品供应商！填补中国工业化无血清细胞培养技术和产品的空白！而罗顺作为健顺生物的掌舵人，更是踌躇满志、信心满满，相信梦圆时分已不再遥远。

专家简介：

罗顺，甘肃健顺生物科技有限公司创始人、总裁。

美国弗吉尼亚理工大学分子免疫学博士，美国哈佛大学医学院Dana-Farber癌症研究所博士后，毕业后加入瑞士生物制药公司（Serono），从事生物制药研发工作20多年，先后在BeckmanCoulter、JRHBiosciences、SigmaSAFC、基因泰克（Genentech）、安进（Amgen）等公司担任要职，主要负责研发技术部门工作，期间创办了GeneXPBiosciences公司。

干细胞培养技术篇2

【关键词】细胞培养室；技术服务与交流；培养室建设与管理

实验室是高等学校从事科研的重要基地，营造一个好的实验研究环境对实验室管理和建设起着至关重要的作用。实验室管理质量的好坏，直接关系到实验研究是否进展顺利。良好的实验室建设，能给研究者带来愉快的心情，同时也能有效的提高研究质量。

细胞培养室是综合实验室的一个重要组成部分,细胞培养技术是生命科学各研究领域的一种最基本、最重要、也是应用最广泛的研究技术之一。对于高等医学院校来说,各生物医学相关学科均建有细胞培养实验室，其规模、档次、技术水平、使用效率、管理模式、服务保障等方面都缺乏统一的标准，普遍存在着小而全、投资分散、资金浪费、缺乏有效管理、无法提供服务保障、不利于技术交流和创新等诸多问题。本文总结了笔者在细胞实验室管理与建设方面的一些经验，并与广大同行进行探讨。

1细胞培养室的服务职能

细胞培养除了需要娴熟的操作技术外，更多的体现在培养技术的过程复杂，无菌要求严格。研究人员掌握该门技术的时间周期较长。如果成天陷入清洗，包装和消毒等简单繁琐的劳动中，就会影响研究人员专心致志地从事研究活动中更重要的环节。建立大型细胞培养室，由专人进行工作流程服务，实验室按研究人员的要求提供标准化、规范化的实验用品和材料，可以极大地提高细胞培养实验室的成功率，确保实验器材符合细胞培养的要求，减少研究人员的无谓劳动。因此可以将研究人员从烦琐的劳动中解放出来，安心从事更重要的研究活动。

2细胞培养实验室的技术交流

细胞培养是一项通用的技术平台。但针对各个研究课题而言，每个研究人员进行细胞培养的目的和要求又各不相同，即既有共性，又有特殊性。一个学科自建的细胞培养室，一般仅局限于本学科领域内有限的研究方向所必需的细胞培养方法和技术，对其它的特殊方法了解不多，因此不利于技术创新。即便是某个研究生掌握的新方法，常常由于毕业分配等原因离开科室，而使新的特殊技术不复存在，不利于特殊技术的建立和完善。

如果大型细胞培养室面向全校开放，自学科的研究人员中具有丰富科研经验的研究人员、博士、硕士等不同层次、不同研究目的和不同要求，他们相互之间不存在利害关系，容易交流，毫无技术保留。每个人的经验和教训很快为大家所用，可极大缩短技术学习的周期和提高新技术的交流。同时，实验室建立了技术档案制度，不同学科的研究人员探索的新技术不会因走人而流失，可以极大地丰富和积累特殊技术，提高技术水平，为后来者提供更多的方便。

3细胞培养室的建设

3．1细胞培养室面积和房间安排实验室的面积应由实验台的长度、净化工作台的大小等仪器设备情况决定，同时还应考虑科研及实验人员有足够的空间，以便安全地进行科研及实验活动。此外,还应设置面积不小于6m2的缓冲间及与工作分开的更衣柜等。如果细胞培养室面积大于一个标准单元，至少应有两个出口，以随时保持畅通。细胞室里的试验台和仪器布局应合理。一般来说，二氧化碳培养箱和净化工台不应对着门摆放，离心机不应离得太远。

3．2培养室的环境和设施①照明以不影响对实验中产生的各种现象的观察为基准，一般采用荧光灯。宜设置专门电力变压器供电,提高供电质量和可靠性；②房间装修密闭性应较高，且不宜开设外窗，设窗主要为采光好，必要时还应安装空调。门、窗、墙表面应涂布便于清洗去污和耐腐蚀的材料。由于细胞原代培养要求较高，设置空气净化装置；③对于配制有毒的试剂，产生较大的气味和有害气体的实验应在规范的通风柜中操作。操作有放射性同位素的实验,应配备个人防护用品和淋浴室,其废液应妥善处理。

4细胞培养室管理制度的建立

4．1消毒清洁制度①每个进入细胞室的工作人员应保证其个人卫生；②进入缓冲间时,应更换洁净的工作服和拖鞋,进入培养室时须戴帽子和口罩。如做原代培养,工作服应消毒；③第一个进入培养室的人员请及时开启空气净化装置,最后离开人员请关闭空气净化装置；④每天实验前必须紫外线常规消毒1h。每周一次卫生消毒工作并做空气细菌培养检查。每月一次全面清洁工作。

4．2培养箱的使用①每天观察二氧化碳压力表,及时更换二氧化碳钢瓶。同时观察二氧化碳流量指示表,同时培养箱内应放置一温度计,记录其温度与指示表温度是否一致；②培养箱应划分不同区域，不同细胞应放不同区域，同时保持适当的湿度；③有的培养箱有高温消毒功能，注意非管理人员不要动此功能键，以免造成某些元件烧毁。

4．3洁净工作台的使用①使用前1h应紫外线照射；②洁净台内也应划分不同的区域，如材料区、操作区、污物区等；③注意安全，特别是酒精灯，如有酒精漏出应立即吸干擦净，如发生意外用纱布、棉布类盖灭酒精灯；④实验完毕,所用过的器皿、杂物必须清理,同时进行台面清洁。

4．4液氮瓶和低温冰箱的管理①定期检查液氮的容量，并做好记录；②存、取细胞株时，注意防冻安全；③存放细胞株时，根据其种类不同，放置不同盒内，同时应标记好名称和时间并记录；④低温冰箱使用时应按其种类划分不同区域，做好标记并记录。

4．5实验室资料管理制度①收集课题计划书、实验路线、操作步骤、操作记录，各种实验的数据及仪器说明书等；②由负责人指定专人负责并督促不同时段内完成。如果有不规范的资料，请有关人员及时纠正；③资料归档后的资料由专人统一管理。若有些课题涉及专利与发明等知识产权问题，应注意保密。

总之,随着现代科学技术的快速发展,适应高等医学院校科研要求,如何建设好和管理好大型细胞培养实验室对于促进学校科学研究水平的提升是值得探讨的课题。

参考文献

［1］张远方.高校合并后实验室管理模式的探讨.实验室研究与探索，2003，22（1）：118-120.

［2］崔冬生，李增宁，顾平，等.细胞培养室管理规则.华北煤炭医学院学报，2004，6（3）：395-396.

［3］陈乃清，宋平，李晓迎，等.改革细胞生物学实验教学,提高学生综合素质.实验技术与管理，2002，19（2）:8-11.

干细胞培养技术篇3

论文关键词：生物技术；伦理问题；思考

21世纪是生命科学的世纪，生物技术的发展对人类和社会的影响深远。而生物技术引发的伦理问题，已成为世界的焦点议题。如何合理的应用生物技术造福人类和社会，是众多学者和科学家急需解决的问题。

一、现代生物技术研究的新进展

进入21世纪，生物技术正处于发展成熟阶段，生物技术的应用已经渗透到我们生活中许多与生物无关的角落。生物技术的发展至今已经揭示了许多生命现象的本质及其规律，但生命现象极其复杂，目前仍有许多课题有待深入研究和探索。目前在克隆、胚胎干细胞、转基因食品、人类基因组计划、组织工程等研究和实际应用等领域取得了成果。

（一）克隆技术。克隆原意是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因都是相同的。克隆技术首先用于动物，动物克隆就是通过无性繁殖方式，由动物细胞产生的遗传形状相同的动物个体。克隆羊多莉是首例克隆成功的动物。动物克隆为我们进一步揭示生命的奥妙及人类的自我认识展现了全新的视野。

（二）胚胎干细胞。干细胞是生物体在生长发育过程中起“主干”作用的高度未分化细胞，它具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能。干细胞分为三大类：全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞。全能干细胞之所以全能，是指它可以分化成人体全部细胞类型，进而构建心、肝、肾、肺等多种组织和器官，最终发育成一个完整的个体。全能干细胞再进一步分裂、分化中又形成了各种多能干细胞。多能干细胞具有分化为多种细胞组织的潜能，但是却失去了发育成完整个体的能力。

（三）转基因食品。转基因食品是利用生物技术将某些生物的基因转移到其他物种中去，从而改造生物的遗传物质，使其在性质、消费品质等方面向人类所需要的目标转变。以转基因生物为直接食品或以这种生物为原料，加工出来的食品都被称为转基因食品。转基因食品在欧美应进入人们的日常生活中。有资料表明，在欧洲，玉米钻心虫每年要毁坏4000万吨玉米，占世界玉米总产量的7%，但是如果把分离出来的抗钻心虫基因植入玉米中去，就可培育出抗虫害的玉米，这种玉米就是转基因食品。

二、现代技术发展引发的伦理问题

（一）关于克隆人的争议。从“多莉”羊的克隆成功，待几年来其他克隆动物的尝试，克隆技术正不断发展。目前科学界把对人体的克隆分为治疗性克隆和生殖性克隆。科学界和伦理界对治疗性克隆普遍支持。但生殖性克隆，即克隆完整的人则遭到很大的抵制。克隆人给伦理道德方面带来了巨大的冲击，对现有的社会关系、家庭结构造成了巨大的冲击。另外，克隆人的身份难以认定，使人伦关系发生模糊、混乱乃至颠倒，进而冲击传统的家庭观以及权利与义务观。

（二）胚盘干细胞研究中的生命伦理问题。由于胚盘干细胞的制备是离不开人类卵子、胚盘以及克隆技术的，而卵子与胚盘在一些不同的国家和宗教界被视为是生命的起源，与活着的婴儿没有什么不同，所以在许多国家是被严格禁止的。坚持认为可以用人类胚胎做实验的人认为：1、早期胚胎仅是一团细胞，尚难称其为人的一条生命，从胚泡内细胞培养成人的胚胎干细胞，并没有杀死细胞，只是改变细胞的命运；2、培养胚盘干细胞是用于治疗现在还无法治愈的组织坏死性疾病，让病人恢复健康，完全是合乎人类伦理道德。

（三）转基因食品的潜在危险。对转基因食品发展有两种态度：支持者极力宣传其带给人类充足的粮食和新型抗病虫策略；反对者则强调人为地用基因技术改变神武，会给人体健康和环境带来危害。基因表达调控是个复杂的生命现象。目前，人类对基因的活动实施了解还不够透彻，还没有十足的把握控制基因中组后的结果。1993年英国的一份报告列出了一些人们对于转基因食品应用的来努力方面的主要担忧：1、人类基因转入食品动物，如将人类基因因子与凝血的蛋白质的基因转入绵羊中；2、某些宗教团体禁止食用的动物基因转入他们通常食用的动物中，这可能触怒犹太人和穆斯林，列入将猪的基因转入绵羊；3、动物基因转入植物中，可能会引起一些素食者的特别关注。

三、现代生物技术发展存在的伦理问题对策

现代生物技术的飞速发展，引发诸多伦理问题，发人深思。为了促进生物技术的和谐发展，应采取相应对策和措施。科学预言，21世纪是生物技术发展的黄金时期，全国普及大众伦理学知识尤为重要，设置伦理学咨询机构，利用各种媒体宣传伦理学知识，增强大众的伦理学意识，提高全民族的整体伦理水平。同时，我们还应改变传统伦理观念，发展中国特色的生命伦理学。总体上，生命伦理学应和国际生命伦理学保持一致，但又要保持中国的特色。另外，培养生命伦理专业人才，解决人才匮乏的局面。生命伦理学的发展任道重远，生命伦理学人才匮乏问题需要解决，设置生命伦理学专业，加快专业人才培养规模势在必行，特别应注重研究生、博士生的培养。

干细胞培养技术篇4

关键词：人才培养模式；细胞工程技术；教学改革

中图分类号G642.0文献标识码A文章编号1007-7731（2014）01-02-152-02

细胞工程是生物制药工业中的关键技术，它是利用动物细胞体外培养和扩增来生产生物产品，或者作为发现和测试新药的工具[1]。就目前而言，高校细胞工程技术教学中还存在着一定的问题，如教学内容陈旧，不适合生物类企业对职员的知识和技能需求；教学方法还停留在高等教育的初级阶段，教学效果不高[2]等。因此，我们必须加快细胞工程技术类型人才培养模式的改革，进行细胞工程技术教学模式和课程的改革与创新，通过有效的教育模式来提高教学质量，让学生既掌握细胞工程关键技术的基本理论和基本方法，又能掌握细胞工程学科技发展中产生的新技术、新方法，提高学生的创新能力。笔者从教学内容与生产、双语教学、生产学习与实验技能几个方面对提高技能型人才培养目标的教学模式进行了探索研究，以期培养学生的学习能力、实践能力、创新能力，全面提高教学的质量和效率。

1教学内容与生产整合

细胞工程学课程内容是按照细胞的主要结构及其功能、相关技术讲解的，课程包括细胞工程学发展史、细胞工程学概述、细胞培养及生物学特性、细胞融合、干细胞工程学、细胞克隆及克隆动物与转基因动物技术等；考虑到细胞培养技术在科研中普遍应用，目前细胞工程学实验课另外开设了免疫组化、荧光细胞染色与细胞分选、流式细胞仪操作技术、图像处理等课程。

本科学习中，细胞工程学教学中主要以各种细胞培养为主要线索，了解细胞工程技术具有特定的研究方式，使得他们对细胞工程学有一个全面的认识。例如，动物细胞工程技术应用于诊断和治疗疾病的单克隆抗体生产，有几千种单抗用于生化检测，而单抗用于人体疾病治疗是近几年来生物制药的一个重要领域，有几十种单抗药物正处于临床试验中。通过实验，学生理解单克隆抗体生产制备技术，并掌握原代及传代细胞培养技术、培养细胞的观察方法、细胞融合和分选技术等方法和常用设备的使用方法，为以后的生产研究做好准备。又如，动物细胞表达系统表达的蛋白都是胞外分泌的，产物的分离纯化过程非常简单，但是由于细胞大规模培养技术比较复杂，目前仍处于发展完善阶段，因而许多重组蛋白仍选用原核表达系统生产。我们针对这个特点，启发同学设计较好的细胞大规模培养系统，如改装的灌流式培养方式，培养和启迪学生的创新思维。

2普通教学与双语教学整合

在当前社会高速发展的时代，社会对细胞工程人才提出了更高的要求，尤其是生命科学院校毕业的学生能否跟上时代的步伐，面向世界进行生物学的交流活动，扩大细胞工程技术在世界的影响，这是细胞工程技术发展至关重要的事。

在细胞工程学原版教材的选择上要力求最基础的专业知识内容水平。我们选择的教材是中国海洋大学出版社2011年10月第1版英文教程《CYTOTECHNOLOGY》，该教材的特点是讲授的内容比较全面，语法简单，对专业性的概念、词汇以及分子水平的知识进行了浅显的讲解，比较适合用于高等院校学生进行细胞工程专业外语的学习，避免学生由于英语基础差，导致对抽象晦涩的细胞工程学课程双语学习产生反感情绪，利于完成双语教学工作。

3生产学习与实验技能整合

学生创新能力和实践能力的缺乏是高等教育教学改革面临的问题[3]。因此，要带领学生参与科学研究与生产实验技能，强化实践教学环节。细胞工程技术实践教学中，联系生物制品企业生产学习很重要，如我们带领学生到福瑞邦制药的厂家参观学习单抗制备，让学生注意在实验操作中可能失败的原因性，出现问题，及时加以纠正，培养学生良好的实践能力。针对细胞工程学的实验教学特点，穿插设计探索性和综合性的实验内容，并让学生自己参与到实验内容的设计，并调动学生的独立思考能力和创新思维能力，培养实验技能和创新思维能力。

实验大纲列出的实验项目较多，可整合为三大部分：（1）细胞培养综合实验。包括培养技术及细胞观察，细胞培养实验还可以将兔角膜上皮、基质及内皮细胞种植于生物材料上进行体外培养，观察培养细胞的生长、排列和细胞的粘附情况等。（2）经典单抗制备综合实验。将单抗制备产生过程中的细胞培养、动物免疫、细胞融合，杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化，抗体检测5个实验内容整合为1个单抗制备设计性实验。教学中不为学生准备传统的实验讲义，只提出实验的任务、要求、进度及安全注意事项等，重点突出学生自行完成相关资料查阅，自拟设计方案，自己安排时间完成实验计划，获得实验结果，撰写实验报告。这个实验计划6个课时，2次课堂实验，分别以实验设计、中期实验讨论与交流、实验结果课件汇报为主要内容。（3）流式细胞仪分选细胞综合实验。包括分选淋巴细胞或是干细胞的筛选，要求学生根据生产实践需要（如奶牛细胞的分选、白细胞计数及分选等）自己选择课题，自己设计实验方法以及最后鉴定。这个实验计划12个课时，4次课堂实验，分别以实验设计、中期实验讨论、实验结果课件汇报为主要内容。所有实验的实验室全天性开放，学生可利用课余时间主动完成各项实验操作，老师指导，确保学生在30d内获得全部实验结果。老师可根据实验结果反馈及时调整教学进程和教学方法。通过学生的反馈，可以反映学生是否理解和掌握本课程的目标，并加强了教师与学生之间的沟通，提高了教学效果。

参考文献

[1]胡显文，肖成祖.细胞工程在生物制药工业中的地位[J].生物技术通讯，2001，12（2）：117-122.

干细胞培养技术篇5

关键词：海马；神经干细胞；培养；鉴定

神经干细胞（neuralstemcells，NSCs）存在哺乳动物胚胎期的大部分脑区，而成体NSCs主要存于脑室周、海马齿状回的颗粒下层、脊髓等部位，其中以海马齿状回的颗粒下层分布较多[1]，因此成体NSCs的研究多以海马脑区多见。传统分离细胞方法采用胰蛋白酶消化方法结合机械吹打方法。但胰蛋白酶消化方法分离细胞存在许多弊端，比如消化过度及终止消化所用的血清对NSCs生长干扰的问题。本实验通过单纯机械吹打方法分离提取乳鼠的海马NSCs，可以完全将海马组织吹打成单个的细胞，所获得的细胞在体外培养的过程中，表现出较强存活、增殖、成球能力和多向分化的潜能。

1.材料

1.1动物

1.1清洁级、新生24h内、雌雄不限SD大鼠10只，由广州中医药大学实验动物中心{许可证号：SCXK（粤）2008-0020}提供。

1.2试剂及仪器

DMEM/F12培养基（1∶1）和B27添加剂购自GIBCO公司；碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）、表皮生长因子（Epidermalgrowthfactor，EGF）均购自以色列Prospec公司；L-谷氨酰胺、双抗（Penicillin/Streptomycin）均购自美国Sigma公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；兔抗巢蛋白（Nestin）、胶质纤维酸性蛋白（Glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）、髓鞘碱性蛋白（Myelinbasicprotein，MBP）及神经元特异性烯醇酶（neuron-specificenolase，NSE）单克隆抗体、相应SABC试剂盒、DAPI染液、抗荧光衰减封片剂均购自博士德公司。超净工作台：苏州宏瑞净化公司；台式低速常温离心机：德国EPPENDORF公司；细胞培养箱：Thermo公司；倒置显微镜日本Olympus公司。

2.方法

2.1NSCs的培养及传代

将事先消毒好的乳鼠置于玻璃皿中，在超净工作台内，用组织剪剪断头部，无菌条件下打开颅腔取出大脑，用预冷的D-Hank’s液冲洗3次。在解剖显微镜下，用眼科镊剔除脑膜和脉络丛，取出海马组织。用组织剪将组织剪碎，加2ml预冷的D-Hanks液，选用1ml移液枪吹打。吹打方法，吸头贴壁置于液体中，轻缓吸取液体，吹打液体时不要将吸头管内的的液体全部吹打完，每次吹打留少量的液体于管内，这样可以避免因吹打引起气泡形成，一般吹打70次左右即可将组织吹成单个细胞。吹打完毕再加2ml预冷的D-Hanks液稀释，经200目筛网过滤，收集细胞悬液于10ml离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，加2mlD-Hanks液，轻柔吹散重悬，制成单细胞悬液，加入含终浓度为20ng/ml的bFGF和EGF、2%B27、1%双抗、1%L-谷氨酰胺DMEM/F12（1∶1）神经干细胞培养基，倒置显微镜下，经台盼蓝染色法计数细胞，调整细胞的的密度，以1×106个细胞/ml密度接种到无菌透气的培养瓶中，于37℃、95%湿度、5%CO2细胞培养箱中培养，隔天30%换液。倒置显微镜下每天观察NSCs生长、增殖及成球的状况。隔天30%换液，大部分神经球直径达到100μm左右即可传代培养。

2.2NSCs分化及鉴定

2.2.1NSCs鉴定

将原代培养3d的NSCs，采用0.125%胰蛋白酶消化成单细胞，以10000个细胞/ml的密度，接种至无菌的多聚鸟氨酸包被盖玻片，采用NSCs条件培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养12h，待细胞贴壁牢固后即可行免疫荧光细胞化学技术检测Nestin（一抗浓度1：100）表达。

2.2.2NSCs分化及鉴定

将第3代NSCs经0.125%胰蛋白酶消化成单细胞，以10000个细胞/ml的密度，接种到多聚鸟氨酸包被盖玻片上，从NSCs条件培养液中撤去bFGF、EGF和B27，加5%胎牛血清诱导细胞分化，培养7d，隔3d换液1次，7d后取出盖玻片，进行免疫荧光细胞化学技术检测NSE、GFAP、MBP（所有一抗的浓度1：100）的表达。

2.2.3细胞免疫荧光染色检测

操作步骤：①PBS清洗细胞爬片2次，每次5min。②4%多聚甲醛室温固定细胞30min，PBS清洗3次，每次5min。③0.3%TritonX-100暴露抗原20min，PBS清洗3次，每次5min。④0.75%H2O2封闭内源性过氧化物酶20min，PBS清洗3次，每次5min。⑤10%山羊血清封闭液封闭非特异性抗原30min，去除多余的封闭液，不洗。⑥分别加兔抗一抗室温静置1h，PBS清洗5次，每次5min。⑦加相应的二抗（PBS稀释1∶100）孵育30min，PBS清洗5次，每次5min。⑧加SABC-Cy3标记三抗（PBS稀释1∶100）孵育30min，PBS清洗5次，每次5min。⑨DAPI核复染，抗荧光衰减封片剂封片，显微镜下观察并拍照。

3.结果

3.1NSCs增殖及成球

原代NSCs接种24小时后，倒置显微镜下可见，细胞数量明显增多，胞体呈圆形，透光性较好，多数细胞悬浮生长，并以单个或2个甚至几个细胞抱团生长，见图1。原代细胞接种96小时后，镜下可见散在单个悬浮细胞数量明显减少，形成许多悬浮的神经球，有的神经球直径可达到100μm左右，球体直径超过150μm，球体中央光线稍暗，表明中部的细胞营养缺乏，生长状态不是太好，神经球的体积过大不利于细胞生长，见图2。

3.2原代神经干细胞Nestin鉴定

Nestin表达阳性，所培养细胞为神经干细胞，如图3。

3.3NSCs体外诱导分化

神经球经胎牛血清诱导培养2h，细胞开始向外迁移，球体周边出现突出，如图4。胎牛血清诱导培养7d后，NSC基本完全分化成各种不同的神经细胞，如图5。

3.4NSCs多向分化潜能鉴定结果

3.4.1神经元鉴定NSE表达阳性，表明细胞是神经元，见图6所示。

3.4.2星形胶质细胞鉴定GFAP表达阳性，表明细胞为星形胶质细胞，见图7所示。

3.4.3少突胶质细胞鉴定MBP表达阳性，表明细胞为少突胶质细胞，见图所8示。

4.讨论

传统的胰蛋白酶消化组织方法分离NSCs，往往会因为消化时间掌握不好而造成对细胞损伤而影响到增殖活力，甚至导致细胞死亡。而且，采用胰蛋白酶消化的方法，需要加血清进行终止酶的反应，因此血清会对需要无血清条件培养基传代培养的NSCs的生长及生理特性有一定的干扰。新生24h内SD乳鼠的脑组织还比较松软，细胞容易吹散，通过轻柔简单吹打的方法也可分离海马NSCs。而单纯机械吹打方法可不但可以使NSCs避免血清的干扰，还可使得细胞具有更好的存活及增殖的能力。

NSCs通过对称和不对称两种不同的分裂方式产生子代细胞，对称分裂所产生的子代细胞均为干细胞，不对称分裂所产生的细胞包括干细胞和祖细胞，其中祖细胞在血清或其他微环境因素的影响下可向神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化[2]。巢蛋白是一种中间丝类型的蛋白，NSCs原代培养3-4d后，可出现抗体反应阳性，在神经迁移及神经分化开始后逐渐消失[3]，可作为NSCs的特异性标志蛋白[4]。神经元特异性烯醇酶是神经元特有一种酸性蛋白酶，是神经元的标志蛋白[5]，胶质纤维酸性蛋白是星形胶质细胞内特有的骨架蛋白，是星形胶质细胞常用的志物[6]，髓鞘碱性蛋白是少突胶质细胞在形成髓鞘前表达的特异性蛋白，也是少突胶质细胞标志性蛋白[7]。NSCs原代培养3d后进行鉴定，Nestin阳性，证明分离培养的细胞是NSCs。NSCs在bFGF、EGF及B27等生长因子作用下，不断的分裂增殖，当除去这些有丝分裂因子，或加血清培养后即可诱导其分化。NSCs撤掉无血清条件培养液中维持细胞分裂的bFGF、EGF及B27添加剂，加入血清培养7d后，NSCs基本可完全分化。经免疫细胞荧光染色，NSE、GFAP、MBP表达阳性，证实NSCs可分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。本实验结果提示通过简单机械的吹打方法分离新生24h内的SD大鼠海马NSCs，可细胞具有较强增殖、成球的能力及多向分化的潜能。

参考文献

[1]徐如祥，姜晓丹，柯以铨，等.神经干细胞[M].北京：军事医学科学出版社，2006：175-177.

[2]TengY，SantosF，BlackP，etal.Neuralstemcells[J].PrinciplesofRegenerativeMedicine，2007，300-308.

[3]李明新，阚世廉，张建国.无血清条件下体外分离培养鼠胚胎脑组织神经干细胞[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13（14）：2696-2700.

[4]LoboMV，AlonsoFJ，RedondoC，etal.Cellularcharacterizationofepidermalgrowthfactor-expandedfree-floatingneurospheres[J].HistochemCytochem.2003，51（1）：89-103.

[5]LiuXC，ZhuY.IsolationofneuraIstemcellsfromthespinaIcordsofhumanfetus[J].ShengliXuebao，2006，58（4）：384.

干细胞培养技术篇6

【关键词】小鼠;胚胎发育;微分干涉差显微术

ABSTRACT:ObjectiveToobservesystematicallyandsetuptheatlasofthewholedevelopmentalprocessofmousepreimplantationembryonicoocytewithdifferentialinterferencecontrast(DIC)microscopy(DIC).MethodsMouseoocytesandpreimplantationembryoswerederivedfrominvitroorinvivofertilization.ThefulldevelopmentalstagesfrompreovulatoryoocytetoexpandedblastocystofmouseembryoswereobservedbyinvertedDICmicroscope，andphotosweretakenbydigitalmicrophotography.ResultsADICatlasofpreimplantationembryosinfulldevelopmentalstageswasformedfrompreovulatoryoocytetoexpandedblastocyst.ConclusionDICtechniqueofferedastereoandfineimageofcell/embryoindifferentstages.Theatlasmadefromthisobservationcanbeusedforreferencetothosewhoneedstocultureandmanipulatemouseembryos.

KEYWORDS:mice;embryonicdevelopment;differentialintereferenceconstrastmicroscopy

随着功能基因组学时代的到来，转基因小鼠、基因打靶(尤其是其中的基因敲除)小鼠、克隆小鼠技术和小鼠胚胎干细胞工程等，已经成为生命科学各前沿领域普遍采用的研究手段。在这些研究中，使用微分干涉差显微镜(differentialinterferencecontrastmicroscope，DIC)技术，对小鼠的早期胚进行细致的观察与操作是不可或缺的关键步骤［1］。笔者对小鼠体内发育或体外受精形成的早期胚各个阶段，用DIC显微镜进行系统观察并实时摄影，形成小鼠早期胚发育全过程图谱，为推广小鼠胚胎操作技术，促进基因功能研究提供实用的基础资料。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物

SPF级ICR小鼠，3周龄雌鼠，体质量15~18g;性成熟雌鼠、雄鼠，体质量30~35g［上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号:SCXK(沪)2003-0003］，雌鼠52只，雄鼠12只。

1.1.2主要试剂

孕马血清（PMSG1000IU/瓶，杭州动物药品厂);人绒毛膜促性腺激素（hCG1000IU/瓶），丽珠集团丽珠制药厂);M2培养基、M16培养基:参照文献［1］配制;KSOM＋AA培养基［2］(EmbryoMax，美国Chemicon公司);矿物油(EmbryoCultureTested，M-8410，美国Sigma公司)。

1.1.3主要仪器

倒置显微操作系统(TE-2000U型，日本Nikon公司);数码显微摄影系统(DP-70型，日本Olympus公司);三气培养箱(3131型，美国Thermo公司);体视显微镜(SZX7型，日本Olympus公司);双人单面净化工作台(SW-CJ-1Cu型，苏州净化设备有限公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠超数排卵

选用3周或性成熟ICR雌鼠为供卵/胚鼠。用于体外受精的小鼠于第1天17-18时腹腔注射PMSG5.0IU，48h后腹腔注射hCG5.0IU，待用;用于体内受精的ICR雌鼠于第1天12时左右腹腔注射PMSG5.0IU，48h后腹腔注射hCG5.0IU，熄灯(20时)前与性成熟雄鼠合笼，自然交配，第4天8时左右检查雌鼠，选有阴道栓者待用。

1.2.2排卵前卵母细胞采集与处理

选取经超数排卵后而未受精的雌鼠，断颈处死，从腰背部打开腹腔，取出卵巢，在M2培养液中用解剖针刺破卵巢上突出的卵泡，释放卵泡内的卵丘团，用20μL移液器吹吸，洗净组织碎片;收集卵丘团，用自制的玻璃微吸管(D≈120~160μm)反复吹吸，去除卵丘颗粒细胞;置于体积分数为0.05的CO2、37℃预平衡的KSOM液滴中，覆盖石蜡油，立即观察。

1.2.3体内受精小鼠早期胚采集与培养

于第4天10时左右(合笼交配0.5d)采集体内受精的受精卵。选取超数排卵并合笼后有阴道栓的雌鼠，断颈处死，打开腹腔，取出输卵管和卵巢，剔除血管和脂肪，在M2培养液中刺穿输卵管壶腹部，挑出卵丘团，以0.1%透明质酸酶消解卵丘细胞，M2洗涤3遍以上，将卵子分成两份:一份直接进行DIC观察;另一份转移至预平衡的KSOM中培养(CO2、温度条件同1.2.2)。

1.2.4体内受精小鼠桑椹胚和囊胚采集与培养

于第4天10时前选取超数排卵并合笼后有阴道栓的雌鼠，做好标记，继续饲养;第7天10时左右(合笼交配3.5d)采集体内受精的桑椹胚和囊胚。小鼠断颈处死，打开腹腔，取出子宫和输卵管，用装有M2培养液的1mL注射器刺穿子宫与输卵管结合部，冲出子宫内的早期胚，M2洗涤3遍以上，转移于预平衡的KSOM中培养(CO2、温度条件同1.2.2)。

1.2.5体外受精和早期胚培养

第4天8~9时在培养皿中做哑铃型M16液滴0.5~1mL，覆盖石蜡油，体积分数为0.05的CO2平衡≥15min;将性成熟雄鼠附睾尾(剔除血管与脂肪)剪碎，放入液滴一侧，体积分数为0.05的CO2、37℃培养5~10min;从哑铃型液滴另一侧吸出运动良好的精子悬液适量，调节精子密度为(5~10)×105/mL，置于培养皿中形成50~100μL小滴，覆盖石蜡油获能培养1~2h(CO2、温度条件同1.2.2)。

第4天10时左右，将经超数排卵的雌鼠断颈处死，打开腹腔，取出输卵管和卵巢，剔除血管和脂肪，在M2培养液中刺穿输卵管腹壶部，挑出卵丘团(方法同1.2.3)。吸取卵丘团在M16液滴中清洗两次，加入到精子悬液小滴中，体积分数为0.05的CO2、37℃授精培养;于授精培养的不同时间将卵子吸出，观察精卵相互作用情况;拟作早期胚培养者于授精培养5~6h后，将卵子吸出在M16液滴中洗涤掉多余的卵丘细胞和精子，并将受精卵分成两份:一份直接观察受精结果;另一份移入KSOM液滴中进行早期胚培养(CO2、温度条件同1.2.2)。

1.2.6微分干涉差显微观察

用口吸管将卵子或胚胎移入玻璃培养板上，石蜡油覆盖液滴，置于倒置DIC显微镜下观察。4×物镜寻找目标，20×或40×物镜观察;调节起偏器、检偏器、光圈和聚光器高度至恰当位置，观察图像呈灰色调、图像浮雕感和反差适中为度。采用数码显微摄影系统进行摄影，所有照片均于20×物镜下拍照。

精子与透明带的相互作用在体外受精实验进行授精培养2h左右，在倒置显微镜下检查，见卵丘颗粒细胞完全散开，透明带暴露明显时即将卵子吸出，吹吸数次，除去粘附精子，以4%甲醛固定至精子制动后置于DIC显微镜观察;体外受精结果的检查，从移入KSOM时，即授精培养6h(hCG后23~24h)起观察单细胞受精卵;排卵前卵母细胞或体内受精的早期胚，从解剖获取细胞/胚胎起观察，此后于连续实验过程的每天上午、下午和晚上各观察1~2次，每次30~90min，记录观察/拍照时间并分别计算图像距hCG注射或受精的时程。

2结果

DIC显微镜观察卵母细胞和各阶段早期胚，见细胞形态呈浮雕状的立体图像，各种结构边界清晰、细节明显，对比度适当，可以准确生动地显示如细胞与细胞核的边界、细胞质内的细胞器颗粒、细胞核内的核仁、染色质颗粒等微细结构。

本研究分8个阶段连续观察早期胚形成与发育的全过程，包括:(1)排卵前卵母细胞；(2)排卵后卵母细胞；(3)受精；(4)受精卵；(5)二细胞胚；(6)四细胞胚；(7)八细胞-桑椹胚；(8)囊胚。每个阶段分别观察≥50个目标，选取有代表性的各阶段细胞/胚胎摄影图像并依据时间次序排列，构成图谱。卵母细胞和各阶段胚胎形态的DIC显微图谱见图1。依照从卵母细胞成熟至囊胚扩展的次序，对卵母细胞成熟和早期胚发育全过程的形态特点概要描述如下。

小鼠卵巢排卵前卵泡中挑取的未成熟卵母细胞，可见卵母细胞肥大，紧贴透明带，细胞质内充满细小的颗粒状物质(简称胞质颗粒);细胞核(生发泡)大而圆，核膜边缘清晰，核内可见核仁及多个染色质颗粒［图1-(1~3)］;部分卵母细胞的生发泡转移靠近细胞表面，胞质颗粒变粗并呈聚集状态，提示细胞骨架发生重组［图1-(3)］。图1-(4~6)为排卵前的成熟卵母细胞，［图1-(4)］示生发泡破裂，胞质颗粒进一步增粗;部分卵母细胞胞质局部呈山丘状突出［图1-(5)］，并排出形成第一极体，胞质颗粒恢复为细小状态［图1-(6)］。排卵后从输卵管壶腹部挑取的卵母细胞与排卵前的成熟卵母细胞在形态上并无显著差别［图1-(7~8)］，细胞质内紧靠极体或附近区域可见纺锤体［图1-(7~8)］，纺锤体处胞质颗粒极少或缺乏。体外受精时，大量精子附着于透明带上，可见卵母细胞因甲醛固定而缩小［图1-(9)］，个别精子穿透透明带［图1-(10~11)］;可见单个精子头部已经穿过卵母细胞膜，并在卵母细胞表层胞质中形成核膨胀［图1-(10~11)］，该处卵母细胞胞质呈锥体状突出成为“受精锥”［图1-(10~11)］;部分卵母细胞在精子核膨胀时即排出第二极体［图1-(11)］。受精后卵母细胞内雌、雄原核形成，早期两原核相距较远，第二极体与第一极体并拢［图1-(12)］;双原核逐渐向受精卵中央迁移［图1-(13)］，并相互靠拢［图1-(14)］，两原核逐渐融合为1个［图1-(14~15)］，核膜清晰，多个核仁清晰可见，细胞体积有所增大，表明原核迁移过程中已经开始进行DNA复制和蛋白质合成，为下一步的卵裂做准备。原核融合后细胞核一分为二［图1-(15~16)］细胞变为多边形并逐渐拉长［图1-(16~17)］，细胞核向两极迁移、细胞中央凹陷，形成“腰”

［图1-(18~19)］;卵“腰”进一步凹陷，细胞一分为二，形成大小相等的2细胞卵裂球［图1-(20~21)］。随后，2细胞卵裂球(也称二细胞胚)内细胞核一分为二，并出现极化分布［如图1-(22~23)。长形的2细胞胚相互旋转并再次卵裂形成4细胞胚［图1-(23~26)］;继而进一步卵裂形成6细胞胚［图1-(27)］、8细胞胚［图1-(28)］、桑椹胚［12~16细胞，图1-(29)］。从8细胞胚开始，细胞之间排列十分紧密，相邻两细胞表面紧贴［图1-(28~29)］。随着胚继续培养，多细胞的桑椹胚内部已难以分辨细胞边界，即所谓致密化［图1-(30~31)］。桑椹胚后期，在胚内部局部出现小的腔隙即胚泡腔，演变为囊胚(亦称胚泡，图1-32);胚泡腔逐渐扩大，部分早期胚细胞形成单层扁平的胚泡壁(滋养层)，另一部分细胞位于胚泡腔一侧，形成内细胞团［图1-(33)］;继续培养，内细胞团的细胞数量增多、体积变小，胚泡腔逐步扩大，胚胎体积增大，透明带变薄［图1-(33~34)］，在充分扩展的晚期囊胚，胚泡壁细胞间结合部特别薄［图1-(35)］，此处是做嵌合体动物时ES细胞囊胚注射的最适合位点。

3讨论

近年来，对小鼠早期胚进行观察、培养和操作，已经超越了传统的生殖生物学和发育生物学专业而成为生命科学众多领域中普遍应用的技术。因此，一个早期胚发育全过程系统观察的图谱，对推广、普及这些技术的应用不仅具有重要的实用价值而且具有较强的紧迫性。

3.1DIC显微术的优点

传统对早期胚发育过程形态变化的认识，来源于利用相差显微镜所进行的观察［1］。由于相差显微镜技术存在着图像不够细致、边缘效应即“光晕”显著的固有缺点，使其不能观察细胞内部和边缘的细节，从而难以适应大多数显微操作的需要，故当前对细胞和胚胎进行显微操作时普遍使用更先进的DIC，尤其是在进行基因原核注射、细胞核移植和胞质内精子注射等实验中，DIC成为不可替代的工具［1］。因此，用DIC观察小鼠早期胚发育形态成为胚胎操作实验中的基本功。然而，迄今尚未见利用DIC对小鼠早期胚发育全过程进行系统观察的报道及其相应图谱，不利于胚胎操作技术的推广。DIC是在相差显微镜基础上改进的新一代活细胞观察技术。利用DIC观察细胞与胚胎，细胞形态呈浮雕状的三维图像，细胞内外各种结构边界清晰、细节明显、对比度适当，尤其是其聚焦深度较狭窄，通过调节焦距可以获得细胞不同层面的图像［如图1-(1~2)］，即对细胞进行光学切片，可以准确、生动地显示如细胞与细胞核的边界、细胞质内的细胞器颗粒、细胞核内的核仁、染色质颗粒等微细结构。目前，DIC已全面应用于对活细胞的观察，并可与其他光学显微技术相结合进行细胞/胚胎的生理功能、染色体运动和分子活动的分析［3-5］。因此，利用DIC来观察胚胎发育过程，可以更准确、精确地了解胚胎的发育状态并便于对其进行细致的显微操作。本研究采用DIC显微术，全面系统地观察从卵母细胞成熟至囊胚扩展的早期胚发育全过程，观察时间点密集，观察样本量大，各阶段标本图像的重现率极高，对一些连续变化过程，如原核迁移、卵裂经过等做了连续追踪并对各阶段的形态特征与胚胎发育时相做了较精确的对应。对一些不易观察的微细的细胞内结构，如成熟卵母细胞纺锤体和穿入卵母细胞的精子，本研究也拍摄了明确清晰的图像。因此本研究形成的图谱可借鉴性强，为推广胚胎培养和胚胎操作技术提供了有价值的实验资料和技术依据。

3.2DIC操作要点

运用DIC技术应注意以下操作要点:(1)DIC的光学特性与玻璃载体(如载玻片、玻璃培养皿等)相匹配，而常规使用的塑料细胞/胚胎培养皿，在DIC观察时易产生入射光的折射而出现颜色变化，降低图像的清晰度和立体感，影响摄影效果。故采用塑料培养皿培养细胞/胚胎时一般只适于进行实时检查，要进行精确观察和摄影时，应将标本转移至玻璃载体上观察。同时，在使用恒温载物台时，要避免采用以塑料为材料的恒温板。(2)DIC具有光染色效果，可调出不同彩色图像，但以灰色调图像的立体感和对比度最强。在灰色调下适宜观察细胞内的微细结构及其差别。因此在做精细观察和显微操作时宜采用此色调。(3)DIC具有光学切片效果，对卵母细胞和早期胚这类较大的目标可通过调节显微镜焦距获得不同层面的清晰图像。在对不同目标进行尺寸比较(例如卵母细胞或胚胎直径)时要注意采用同一层面的焦距进行观察，例如在比较不同胚胎的大小时可采用最大直径的层面进行观察。(4)在转换标本或者视野时应注意观察图像效果的变化，必要时可通过细致调节起偏器、检偏器、聚光器光圈达到最佳效果。

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