细胞生物学研究篇1

摘要:概述了植物细胞分化的模式系统———管状分子分化实验系统的建立以及基于该系统的管状分子分化的生理学、细胞学、生物化学和分子生物学等方面的研究进展，并对今后的研究方向进行了展望。

关键词:百日草;次生细胞壁;细胞分化;管状分子

管状分子(TraehearyElements，TEs)是维管植物木质部内导管和管胞的总称，皆为长柱状细胞，次生壁木质化，成熟后均缺乏原生质体，其功能是输导水分、矿质元素和机械支持作用。导管和管胞差别是，管胞无穿孔，管胞间壁仅有具缘纹孔，借以实现物质转运;而导管分子间的某些区域具有穿孔，多个导管分子通过末端的穿孔连接形成一个长的管道，即导管，与管胞相比，其输导能力大大增强。管状分子来源于形成层，由形成层细胞经过细胞扩增、次生壁沉积、胞内物质自溶、形成端壁穿孔等步骤而形成。管状分子分化已被作为植物细胞分化的模式系统，在形态结构、生化和分子组成、发育及生理功能上都具有明显的特点，是植物解剖学、发育生物学和细胞生物学的研究热点之一。多年来，各国学者建立了整体实验系统和离体实验系统，对管状分子的形态解剖学、生理学以及分子机制进行了一定的研究。其中，百日草(ZinniaelegansJacq．)叶肉细胞离体培养系统是目前分化效果最好的实验系统，人们利用该系统开创性地研究了离体条件下管状分子分化的基本过程，并对管状分子分化的细胞学、生理学、生物化学和分子生物学进行了卓有成效的研究。笔者拟对30多年来人们利用百日草叶肉细胞离体培养系统的研究成果进行概述，为进一步阐明管状分子分化机制提供基础。

1离体实验系统的建立

因为管状分子形态随着分化进程而发生显著变化，其中包括环纹、螺纹和网纹次生细胞壁(SCW)的形成以及自溶作用。所以，管状分子分化被认为是植物细胞分化的模式系统。然而，大多数早期关于分化的研究，采用的是多细胞系统，这样的系统包含几种作为起始材料的细胞类型，为追踪单个细胞分化过程带来了困难。Kohlenbach和Schmidt发现，以机械法分离的单个百日草叶肉细胞可直接分化为管状分子，这促使Fukuda和Komamine在此基础上，建立了一个有效的、高频分化的实验系统。该系统已被全世界许多实验室广泛应用，有时根据特定情况仅仅对一些细节进行了修改。用液体介质浸渍百日草叶片，研磨后，以小网眼筛过滤，液体介质反复漂洗悬浮液，分离得到单个叶肉细胞。要注意:(1)材料要适当。取幼苗第一对叶，而非成年植物最嫩的叶片。(2)条件要适当。旋转培养转速为10r/min，0．3～0．4mol/L山梨醇调节渗透压，生长调节剂为0．1mg/La-萘乙酸(NAA)和1mg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)，起始细胞浓度为(0．4～3．8)×108细胞/L。这样，几乎30%分离叶肉细胞，在适当的离体培养条件下，可半同步地分化为管状分子。

2细胞学、生理学和生物化学方面的研究

百日草实验系统的建立促进了管状分子分化诸多方面的研究。初步的细胞学和生理学研究表明，细胞分裂不是管状分子分化的前提条件，而一些DNA合成在分化中发挥重要作用;以肌动蛋白依赖的微管重组，限定了次生细胞壁的特有格局;分化过程是动态的，细胞变化表现在次生细胞壁沉积前细胞器数量的增加，次生细胞壁沉积开始不久次生细胞壁木质化启动，原生质体逐渐自溶，初生壁非木质化部分的局部水解，分化过程终止。另外，百日草系统已清晰地证明，管状分子分化受植物激素诸如生长素、细胞分裂素、油菜素内酯、赤霉素、一氧化氮、乙烯、信号肽(例如CLE肽、木质素、植物磺肽素)的调控;另外，大量生化和免疫学研究，揭示了细胞壁成分诸如纤维素、木聚糖、木质素和其他次生壁特有分子的变化，以及自溶过程中的各种事件，诸如蛋白质和核酸的降解等。

3相关基因的鉴定与描述

人们也用分子生物学方法，进一步分析了百日草实验系统中管状分子分化的分子机制。运用同源克隆法(例如，核酸酶ZEN1，肉桂醇脱氢酶和过氧物酶，b-微管蛋白，油菜素内酯合成酶和Rho/RacsmallGTPases)，差示筛选法(例如，分化标记，管状分子分化相关的(TED)2-4(Tra-chearyElementDifferentiation-related(TED)2-4)，果胶裂解酶)，消减杂交法(例如，核糖核酸酶及分化标记、蛋白酶和木质素合成酶)、全面的转录组分析微阵列和cDNA-AFLP，分别鉴定了许多与编码管状分子特定事件相关蛋白质的cDNA，和限定管状分子分化特定阶段的标记蛋白。因为百日草转化方法尚不稳定，所以其分离基因的功能分析受到很大制约(例如，果胶裂解酶ZePel，TED4，过氧物酶ZPO-C)。然而，最近，通过基因枪法和电穿孔转染法，瞬间将基因或双链RNAs导入百日草细胞，成功地描述了其他基因的功能，这可能为管状分子分化相关基因功能的分析提供了有益的线索。

4其他植物的研究

在利用百日草实验系统，研究管状分子分化调控的基础上，建立了拟南芥人工培养细胞的管状分子分化系统，该系统在油菜素内酯调控下，有30%～50%继代细胞分化为管状分子。后续的基因芯片分析表明，多数拟南芥基因在管状分子分化期间特异表达，这些基因包括编码植物特定NAC-do-main转录因子VND1-7的基因家族，借以最终揭示长久以来寻找的管状分子分化的转录开关。在某些植物和人工培养细胞中，VND基因被作为管状分子异常分化的有效诱导物。

5待解决的问题和未来研究展望

管状分子分化百日草叶肉细胞离体实验系统的研究在草本植物中广泛展开。该系统为诱导和促进管状分子分化的研究建立了有效的平台，并获得了一些关键基因和调节因子，初步揭示了管状分子分化的机制，为在单细胞水平上认识细胞分化和转分化途径、分化过程影响因素提供了可能，但复杂、精确的分子机制的构建仍需进一步研究。

(1)管状分子分化具有复杂的时空特异性，调控网络综合而庞大，虽然生长素和细胞分裂素是管状分子分化的基本调节激素，已有学者对2者进行了大量研究并取得一定的成果，但是其他激素诸如赤霉素、乙烯、脱落酸、油菜素内酯等作用效果研究资料极少，所以，植物激素作用机制的研究尚未明确。

(2)管状分子分化是植物细胞凋亡的典型例子，成熟的管状分子丧失了细胞核和细胞内容物，成为死的、中空的管状细胞。目前对管状分子细胞凋亡的信号转导途径知之甚少，需要进一步探索。

(3)以草本植物百日草，甚至拟南芥为材料得到的管状分子分化的初步机制，是否适合木本植物，尚需验证。

(4)虽然百日草系统较为成熟，管状分子分化率和同步性较高，但随着研究的深入，仍需进一步改进和优化游离单细胞的离体培养方法，摸索分化的最佳条件，提高分化率和同步性。

细胞生物学研究篇2

关键词：研究生；创新能力；细胞生物学

中图分类号：G643文献标志码：A文章编号：1674-9324（2015）26-0265-02

人类社会已经步入创新不断涌现和竞争不断加剧的重要时期。在知识经济时代，科学技术创新是国家发展的决定性因素，是国家竞争力的核心，而科学技术创新离不开具有创新能力的高素质人才。高等学校担负着全面推进素质教育，培养高素质的创新型人才的历史使命，更新教育观念，深化教育改革，构建高校创新型人才培养模式成为第一要务。教育观念的更新，首要更新的是高等教育体系中庞大的师资队伍，他们是教学改革的执行者，是课堂和实验教学的组织者，是学生创新能力培养和素质提高中最有力的影响者，毕竟学生创新能力的提高是多学科、多层面长期共同努力的结果。

细胞生物学被列为生命科学的四大基础学科之一，是在生命科学领域和高等教育体系中均占有重要位置的前沿学科。医学领域的许多重大发现与细胞生物学实验技术的发展创新有着密不可分的关系，掌握细胞生物学的基本理论和实验技术对医学院校的硕士研究生培养而言意义日益突出。在医学研究生课程体系中开设的细胞生物学课程，在有助于帮助学生掌握基本技能、培养科研思维的同时，如何利用课程授课的机会，培养学生的创新能力，做好创新能力培养的关键一环，是我们当前面对的教育课题之一。我们在研究生细胞生物学教学中更有针对性地加强创新能力和实践能力的培养，在教学内容、教学方法和考核方式等方面进行改革探索，在教学改革的实践中对改革的迫切性、系统性有了更深的体会。

一、更新教育观念，加强师资队伍建设

1.教育观念更新是前提。我们在教学实践中也认识到忽视能力培养是制约创新型人才成长的主要原因，具体表现在三个方面：一是忽视实践能力的培养，按着教学计划和教科书一章一节地向学生讲授，学生熟背理论而与实践脱节。二是忽视自主能力的培养，限定领域不考虑学生的兴趣和爱好，不主张学生的自主发挥，学生理解书本但不会思考。三是忽视学生探索能力的培养，只学习已有结论和经验，忽视未知领域的大胆探索和形成结论的深入研究[1]。在实现硕士研究生创新能力培养的过程中，导师及教学团队的教学观念的更新是前提，也是基础。各指导教师的创新力的保持和对教育教学先进理念和技术的不断学习有助于保持教学的生命力。

2.师资队伍加强是保障。国务院学位委员会办公室主任、中科院院士杨玉良曾说过：“改革研究生培养机制、不断提高研究生教育质量，加速培养创新型人才，是一个复杂的系统工程，不仅要重视提高研究生本身的质量，更要重视提高研究生导师的质量。”[2]研究生和导师之间关系的满意度调查显示师生双方的总体满意度较高，但依然存在一定的问题，并认为导师的学术素质是影响研究生培养的关键因素之一[3-4]。我们的师资队伍建设目标是业务精湛、勇于创新、师德高尚、教风严谨，梯队合理。搭建技术力量雄厚的师资成为高素质创新人才培养的强有力的保障。我们在师资队伍的建设中，重引进也更重培养，引进看学历、选专业、重学缘，培养分批次、重坚持，力求优势互补；在日常工作中，我们以小型的学术报告会的形式加强交流，互助共进；在梯队建设上，看重专家教授的经验，也注意吸纳思维活跃的中青年学者；并依据多学科交叉和融合，学生的兴趣主导，确立了双导师制，并注意双师型教师的培养。

二、深化课堂改革，推行创新课堂

1.课程设置合理化。研究生课程体系的设置做到适时调整，丰富选课资源的同时，加强学生选课的自主性，充分考虑学生的个性化培养的需求。

2.优化教学内容。创新型人才培养模式改革首要是课程改革，而课程改革首先要解决的问题是教学内容的优化。研究生创新能力的培养应该是建立在知识、能力、素质的辩证统一的基础上。知识作为能力和素质的载体，是不可或缺的重要一环，研究生阶段知识的获取不应该局限于本科阶段的某一本教材的重复拓展。我们在课堂设计中集思广益，打破教材的局限，以学生兴趣为出发点，设置了十个小的专题题目，专题内容涉及细胞生物学的基本技术及其创新、前沿知识、热点领域，并充分考虑细胞生物学与医学的密切关系。如细胞通讯、细胞信号跨膜转导及其与疾病的关系，端粒、端粒酶和肿瘤的关系及其研究进展，细胞骨架与运动和神经系统疾病的关系举例（原因分析、分子细胞学调整、研究进展）等。学生既能从中巩固提炼的基本理论框架，又能获得丰富的前沿信息，在学习中还有助于科研方向的确立和科研思维的培养。

3.改革教学方法。我们在前几年的教学中留心对研究生的理论基础、能力水平和喜欢的教学模式做了问卷调查，相对于本科生研究生阶段学生的特点突出表现为：已经具有比较广泛、系统的理论知识基础，并具备一定的分析问题的能力，更向往自由的思维和互动表达。综合研究生的特点和现代教育技术的发展，我们在课堂教学中试行教学方法改革，彻底改变教师灌输知识的单一模式，更多地让学生自主学习，教师担负引导、组织实施、总结和考评的职责，更多的时候也是讨论和争论的主体之一，变师徒关系为伙伴关系。具体实施是依据学生兴趣分组，3～4人/组，组内分工协作，依据自己所选的感兴趣的专题查阅资料，开展讨论并推举一人以PPT文稿的形式图文结合在课堂上汇报讲解，同学可以自由提问，教师做针对性的点评、补充。创新的课堂组织从学生的兴趣出发保障了自主学习的效率，协作中锻炼了学生的团队意识和合作能力，课堂表达和提问互动有效地活跃了学习气氛，调动了学习的积极性，并提高了学生综述及表达能力。此种形式受到了选课学生的一致好评，也吸引了更多的研究生加入我们的学习队伍中。

4.考评手段合理化。在转变教师单向传授知识模式的同时，打破以考试分数作为衡量教育成果的唯一标准的划一呆板的考评制度。对学生学习的评价主要是课堂表现和实践实训，各占50%。课堂表现的评价中以小组汇报讲解中的综合能力表现作为主要的考评指标，并逐步完善了评分标准，简介如下：基本原理简明扼要、切中要点、通俗易懂；研究应用举例典型、兼顾多方面；重视结果分析（尽量使用图表）；重视技术发展的进展和研究理论进展（突出新意）。除了陈述者有奖励分之外，课堂提问及回答者都有酌情加分，极大地调动了学生的积极性。学生课前准备、课堂提问、课后总结的学习资料都可以组织建立个人学习档案，学习档案也可作为酌情加分的因素。

三、反馈与思考

教学内容、教学方法及新的考评方法改革的突出优势在于爱护和培养学生的好奇心、求知欲，帮助学生自主学习，独立思考，保护学生的探索精神、创新思维，营造崇尚真知、追求真理的氛围，为学生的禀赋和潜能的充分开发创造一种宽松的环境。让学生感受、理解知识产生和发展的过程，培养学生的科学精神和创新思维，重视培养学生收集处理信息的能力，获取新知识的能力，分析问题和解决问题的能力，语言文字表达以及团结协作能力。

但在试行新的教学方法的同时，我们也发现了一些有待于改进的问题。在课程体系的设置中需要合理调研，依据社会、培养目标和学生主体的需求做出调整，充分适应多学科交叉融合的需求。在教学内容的优化上，学生更注重研究进展的讨论和热点文献的分析，教学内容需要每年更新，不能一成不变。在教学方法改革中，试行讨论式课堂的问题反应在四个方面：个别小组成员因自制力不强、计算机水平限制、口头表达能力欠缺等原因对所选专题的基本理论或研究进展陈述不清楚，会一定程度上影响其他同学对该专题领域的学习。在课堂汇报环节，受部分同学表达能力的影响，学生的注意力不容易集中，课堂进展的节奏会略显拖沓。在教学过程中容易出现两极分化的现象，部分学生的主动性得到了很好的发挥，综合能力得到了比较充分的锻炼，也有个别学生在混学分，并没有进行真正的自主学习。且教师对新的教学方法的理解和掌握的程度也一定程度上影响了学生的学习效果。在评价体系中，给学生公正、全面、合理的评价影响着学生的学习态度和热情，但其过程是相当烦琐的，需要教师团队比较多的精力投入，适当的激励机制能更好地配合教学改革的推进。

四、展望

创新能力是科技发展的核心动力，硕士研究生培养作为高等教育的重要一环，更需要创新能力。硕士研究生创新能力的培养需要更多体现在实践实训中，是一个循序渐进的过程，需要学校、学院、导师和学生等多个主体的重视和参与，但基础是作为硕士研究生培养的导师或导师团队中的每一位教师，都能保持教育改革的热情，及时地发现现代教育中存在的问题，并能拥有足够的改革的勇气和决心。教师的教育理念的转变和教学技术、方法的不断提高完善，才能真正推动硕士研究生创新能力的培养。

参考文献：

[1]江龙华.论基于创新型人才培养的高校教学模式改革[J].现代大学教育，2007，（5）：102-105.

[2]周晋，王树叶，刘述川.医学研究生教育的发展与创新[J].西北医学教育，2007，15（5）：787-789.

细胞生物学研究篇3

【关键词】化疗增敏电磁波

[Abstract]Chemotherapyisaprimaryclinicaltreatmentforcancer,butitslackofselectivesensitivityandseveresideeffectslimititswidespreaduseandapplication.Thisarticleexplorestheuseofexperimentaltechniquesinbiologyandelectricalengineering.Basedontheobservationthatelectromagneticwavescontroltumors,westudyhowthesewaveshelpwithsensitizationduringchemotherapy,andhowthismayleadtoanewwaytoimprovechemotherapytreatmentsforcancer.

[Keywords]Chemotherapy；Sensitization；Electromagneticwaves

引言

随着人类生活环境、生活水平和生活方式的变化以及医学的进步，疾病谱发生了显著的变化，一般性传染病逐渐被控制。而恶性肿瘤则日益成为常见且严重的威胁人类生命和生活质量的主要疾病之一。化疗是临床癌症治疗最主要的成熟的治疗手段之一。但化疗所存在的药物缺乏特异的敏感选择性及同时存在的严重的副作用等制约其在临床实践中的推广和应用。如何提高放疗药物的敏感性是过内外科研、制药和医学界专家十分关注的前沿问题。

一、研究背景

包括人类在内的多细胞机体均存在细胞的不断增殖与死亡。细胞的死亡包括坏死(necrosis)和凋亡(apoptosis)两种方式。细胞的凋亡是细胞主动的自杀过程，是由基因所控制的细胞自主有序的死亡，凋亡体可从上皮细胞表面脱落或被周围细胞吞噬清除，不伴随坏死所特有的炎症反应。凋亡对维持机体的正常发育及内环境的稳定起着十分重要的作用。

在细胞凋亡的诱导中，作为肌醇磷脂代谢途径中细胞信息转导的第二信使，细胞内钙离子（Ca2+）起着十分重要的作用。胞内Ca2+浓度的改变是细胞生理活动的重要物质基础，并在细胞信号转导、诱发一系列细胞功能事件中起重要作用。因此，细胞内Ca2+浓度平衡处于严格的调节控制之中。研究发现，细胞内Ca2+浓度的高低调控着多种类型细胞的凋亡，具体表现为Ca2+内流和聚积可诱导多种细胞凋亡，被认为是细胞凋亡的共同途径。而用钙通道拮抗剂等方法阻止Ca2+内流则可减轻细胞损伤，抑制细胞凋亡。

化疗药物对癌症治疗有效的主要机制之一是诱导癌细胞凋亡。参与调控细胞凋亡的因素很多，包括细胞外信号、细胞内第二信使及细胞内各种酶类。Ca2+作为参与许多生命活动的第二信使，其在调控细胞凋亡中的作用尤其受到关注。大量实验发现，化疗中细胞凋亡主要由细胞内Ca2+介导；化疗药物在诱导对癌细胞的杀伤时均与癌细胞中的Ca2+浓度的增加密切相关。

但目前的化疗方法还存在重要不足。化疗药物缺乏特异的敏感选择性，在杀死癌细胞的同时，也同样会杀伤正常细胞，并由此产生较为严重的副作用，如骨髓抑制、肾毒性导致肾衰、肌体免疫功能抑制、肝功能损伤、胃肠道反应、脱发、口腔溃疡等。另外，毒副反应还会使化疗药物的剂量和疗程受到限制，导致化疗失败。

另外，癌细胞对化学治疗药物产生多药耐药性是癌症治疗不能取得治愈性疗效的重要原因之一。多药耐药性是指癌细胞在接触一种抗癌药物后产生了耐受包括本药物在内的多种结构迥然不同、作用机理也大相径庭的抗癌药物的抗药性。国内外学者在器官、细胞和分子水平上对如何克服癌细胞耐药性的问题，进行了大量研究，发现了一些具有逆转癌细胞多药耐药性的药物，称为化疗增敏剂，其中引人瞩目的是Ca2+通道阻滞剂。Ca2+通道阻滞剂的作用机制是能选择性地阻断Ca2+经细胞膜上的Ca2+通道进入细胞内，从而降低细胞内的Ca2+浓度。但Ca2+通道阻滞剂作为一种具有心血管药理作用的药物，除了可能引起患者的传导阻滞、低血压、充血性心力衰竭等心血管系统的严重毒性反映外，还可能对患者的免疫系统和造血系统产生不利影响。

二、研究思路

从前面的介绍中可以看出，癌症的发生和发展取决于细胞的增殖与凋亡是否平衡，而细胞的凋亡受胞内第二信使Ca2+的调控。化疗是目前治疗癌症的主要方法之一，胞内Ca2+浓度增加是不同化疗药物诱导癌细胞凋亡的共同通路。但化疗还存在重要缺陷：化疗药物在诱导癌细胞凋亡的同时，也会对正常细胞产生同样的杀伤；化疗中癌细胞会产生多药抗药性，从而导致化疗失效，适合临床使用的化疗增敏方法目前尚未找到。

细胞中的Ca2+在癌症的发生、细胞的凋亡、化疗对癌细胞的杀伤等几个方面都起着重要作用；而在特定参数的电磁波干预下，正常细胞和癌细胞中Ca2+浓度可以产生不同的变化。所有这些都为下列问题的提出打下了基础：能否使用特定参数的电磁波与化疗药物协同作用，其中电磁波参数的选择使癌细胞可产生窗效应，而正常细胞不会有窗效应时，使电磁波与化疗药物分别诱导胞内Ca2+浓度升高叠加，并共同介导癌细胞凋亡，正常细胞则不会出现这样的叠加，从而相对降低化疗药物对正常细胞的毒副作用？Ca2+通道阻滞剂通过对细胞中Ca2+浓度的影响，来逆转癌细胞的多药耐药性，但它会引起许多副作用而不能实用于临床。注意到电磁波的非热生物窗效应也可影响细胞中Ca2+的浓度，那么电磁波能否用于逆转化疗药物的多药耐药性？需要哪些条件？

三、研究基础

1.实验结果发现癌细胞内Ca2+出现窗效应对电磁波参数的要求相对正常细胞有其特点，即既有相同的一面，又有不同的情况。结合这些特点设法增强化疗药物对癌细胞敏感性杀伤能力的研究已经起步。初步的离体细胞层次的实验表明，一定参数的电磁波可以提高化疗药物对癌细胞的选择性杀伤能力，对正常细胞的杀伤相对可以减轻；

2.初步建立和改进了不同癌细胞株及其正常对照细胞株、多药耐药性癌细胞株在电磁场干预下化疗药物诱导凋亡的体外细胞研究模型。其中利用改进的多药抗药性离体细胞实验模型相比传统模型具有抗药性程度高，性能更稳定的优势。

以上理论分析和研究表明，无论从科学研究还是临床医学的要求来说，都需要开展对电磁波非热生物效应的进一步研究，探讨电磁波对正常组织细胞和不同种类癌细胞的作用规律和作用机理，并将其应用于改进癌症的治疗，以造福患者和社会。

四、研究方法

1.宽频专用横电磁波传播小室即TEM小室(TransverseElectromagneticCell，横电磁波传输小室)的研制，可产生不同参数、不同类型的电磁波，且这些参数均可以实时准确测量；

2.建立和改进不同癌细胞及其正常对照细胞、多药耐药性癌细胞在电磁场干预下化疗药物诱导凋亡的体外研究模型；

3.对不同类型癌细胞和正常对照组细胞进行电磁波作用下的非热效应发生条件研究。改变电磁波的类型和参数，反复进行实验，记录各组实验的照片和数据；分析提取可使癌细胞和正常对照组细胞发生非热生物窗效应对电磁波参数的不同要求；

4.从细胞和分子层次的生物学实验研究、生物系统建模和细胞病理生理等角度对实验结果进行分析解释，探讨癌细胞电磁波非热生物效应的发生机理；

5.在可使癌细胞发生窗效应，而正常细胞不发生生物窗效应的电磁波协同化疗药物作用下，应用验证细胞凋亡的几种不同方法检查细胞凋亡情况，分别研究化疗药物诱导癌细胞和正常细胞凋亡的情况，分析提出电磁波对化疗增敏方法与效果；

6.在上述工作的基础上，逐步研究可供动物实验和临床应用的电磁波协同癌症化疗增敏技术。

五、初步成果

本课题研究小组对电磁波干预不同生物组织的非热生物学效应进行研究，完成二十多例次实验，取得了一些规律性的有价值的结果。

1.不同强度的电磁波对癌细胞增生有明显抑制作用。

选择不同强度的电磁波(5mT、8mT、11mT)对人舌鳞癌细胞进行连续3天的辐照刺激,每天1h,通过MTT法和流式细胞术检测细胞的增生、凋亡和细胞周期的变化.对照组采用相同的实验条件和作用时间但不加磁场辐照。结果MTT法检测实验组与对照组辐照后24h、48h、72h的OD值,通过SPSS软件分析显示实验组比对照组的OD值显著降低(P

由此得出结论：不同强度的电磁场辐照对人舌鳞癌细胞增生有明显抑制作用,并可阻滞细胞周期,但对舌鳞癌细胞的凋亡未发现明显影响。

2.电磁波作用于不同癌细胞及其正常对照细胞时胞浆Ca2+浓度窗效应的实验研究。

基本步骤是：制备各种细胞样品，包括三种癌细胞及其对照正常细胞；对不同细胞样品进行荧光负载，后用D-Hank’s液洗涤。先将每一样品在激光扫描共聚焦显微镜下进行荧光强度检测，首先获得没有电磁波作用时的基础数据；之后将这些样品放在电磁波照射系统中接受电磁波辐照，并再次将每一样品在激光扫描共聚焦显微镜下进行荧光强度检测，以获得照射后数据；改变电磁波的类型和参数，反复进行实验，记录各组实验的结果；然后，对数据进行分析，包括有电磁波作用和无电磁波作用时的数据分析、不同参数电磁波对同一样品作用时的数据分析、不同种类癌细胞对不同参数电磁波作用时的窗效应表现等；最后，通过对各参数电磁波产生或不产生生物学效应的总体分析，寻找出哪些参数电磁波会产生细胞Ca2+的生物学窗效应并对其规律进行归纳总结，特别注意癌细胞相对于正常对照细胞所表现出的不同窗效应特性。

我们采用的荧光探针(试剂)为Fluo-3，由于Fluo-3为极性大的酸性化合物，难以进入细胞，而当其结合上亲脂的乙酰羟甲基酯(AcetoxymethylEsters，AM)成为脂溶性的Fluo-3/AM，再与细胞孵育时，就很容易透过细胞膜。电磁波对细胞样品的作用是通过TEM小室来具体实现的。采用TEM小室是为了获得在较大范围内参数一致的、被屏蔽的均匀平面电磁波，这样，既便于进行准确的生物电磁剂量估计，又可使各样品处于相同的、不受外界干扰的辐照环境中。

实验研究表明，癌细胞表现出的窗效应相对于正常细胞有其类似的一面，但也显示出明显差异。具体表现为，在频率为16Hz、强度为42.5V/m的电磁波作用下，肝癌细胞和正常对照肝细胞均会出现胞内Ca2+浓度明显改变的（频率）窗效应，但肝癌细胞在同样强度、频率为45Hz的电磁波作用下也会出现窗效应，而正常肝细胞在该频率电磁波作用下则不会出现窗效应。

3.特定参数电磁波协同化疗药物作用对提高癌细胞选择性杀伤效果的实验研究。

首先分别培养各种正常细胞和癌细胞样品株，对正常细胞和癌细胞分别加化疗药物后将这些样品放在该癌细胞可产生生物窗效应（对正常细胞不会有窗效应）的电磁波照射系统中接受电磁波辐照。选择不同时间点观察电磁波协同化疗药物作用下对正常细胞的杀伤情况和癌细胞凋亡的情况，研究电磁波协同改善化疗敏感性的条件和方法；对选择性诱导癌细胞凋亡、相对减轻正常细胞损伤的效果做出评价。

窗效应的产生取决于施加的脉冲场强、脉冲时间、细胞大小、细胞种类以及悬浮液或周围组织的条件。通过电脉冲联合低剂量顺铂治疗异种移植人卵巢癌SKOV_3裸鼠，取得了很好的疗效，为特定参数电磁波协同化疗药物作用对提高癌细胞选择性杀伤效果的应用打下了基础。实验表明：高幅度电磁波对肿瘤具有较强的抑制作用，其对肿瘤的治疗作用具有选择性，这种选择性与肿瘤组织的特性以及肿瘤细胞的生物学特性有关。实验中采用的药物剂量远远低于常规化疗剂量，并且在肿瘤部位直接给药，减少了药物总量以及药物的全身循环，毒副作用小。通过对化疗后的裸鼠肾脏做病理检察表明：低剂量药物未造成裸鼠肾功能的损伤。高幅度电脉冲对肿瘤血管的生长具有明显抑制作用。经电场处理的肿瘤表面几乎无血管分布，而未经电场处理的肿瘤表面血管丰富。采用免疫组化法检测肿瘤病理切片中血管内皮生长因子VEGF受体KDR的表达，经电场处理的肿瘤的VEGF受体KDR明显下降，肿瘤血管的生长受到明显的抑制。说明高幅度电场抑制了肿瘤血管的生长，减少或完全切断了肿瘤的营养供应，促使肿瘤细胞凋亡或坏死，达到了治疗肿瘤的目的。

在利用特定参数电磁波协同化疗药物作用对提高癌细胞选择性杀伤效果时应该选择合适的脉冲参数。

六、研究特色

1.通过大量实验，可以系统研究电磁波作用于不同癌细胞和正常对照细胞株时胞内Ca2+运动的生物学窗效应规律，也为进一步探讨其发生机理提供了更好基础。

2.在特定参数电磁波协同化疗药物的作用下，研究增强化疗药物对癌细胞选择性凋亡诱导能力的方法。这些研究的开展，可以为克服临床化疗中存在的困难提供新途径。

3.建立和改进了癌细胞株在电磁场干预下化疗药物诱导凋亡的体外细胞研究模型。我们建立的模型相比传统方法有抗药性程度高，性能更稳定的特点。

4.动物实验和临床研究中的一些问题，涉及电磁波应用于动物或人体时的使用方法、身体介质衰减和体内分布估计，电磁波协同化疗药物作用时的时间和效果分析。

结语

本项目拟研究电磁波的生物效应对肿瘤化疗增敏的效果与其作用的机理，旨在提高肿瘤化疗治疗效果的新途径，属探索性基础研究。但因此项目涉及提高社会资源消耗极大的肿瘤医疗效率提高的问题，所以，即使在项目研究进展上取得很小的突破，也将具有极广阔的经济与社会前景，对肿瘤化疗的治疗效果产生深远的影响。

【参考文献】

【1】郭鹞陈景藻《电磁辐射生物效应及其医学应用》中国工程咨询2003

【2】张智军唐露新《电磁波的生物学效应研究进展》科技创新导报2007年36期

细胞生物学研究篇4

【关键词】甲状腺干细胞；甲状腺肿瘤干细胞；状癌；未分化甲状腺癌；致瘤性

甲状腺癌是临床上最常见的内分泌恶性疾病，也是内分泌肿瘤中最常见的死亡原因。近年来其全球发病率一直处于上升阶段，尽管越来越多的新技术已经应用到临床的诊断和治疗中，但随着对其分子学发病机制的深入研究，分子靶向治疗将会是未来诊断和治疗甲状腺癌的一个新方向。

在临床上甲状腺癌的病理类型主要包括状癌、滤泡状癌和未分化癌。其中大部分肿瘤都发生于内胚层起源的滤泡细胞，这是甲状腺组织中细胞数目最多的一部分。状癌和滤泡状癌分别占甲状腺肿瘤的80%～85%和10%～15%，这两种病理类型分化良好，在临床治疗上主要采取外科手术后化疗或放疗的治疗方法，预后良好[1]。与其相反，临床上罕见的未分化癌通常呈一个高侵袭性、进展迅速的恶性临床过程，因为这类肿瘤缺乏摄碘受体故对化疗或放疗不敏感，临床预后较差。目前临床上主要用紫杉醇治疗未分化癌，然而这也并不能有效地减弱它的恶袭能力，因此迫切地需要新的治疗手段。除了这些来源于滤泡细胞的肿瘤外，还有一种来源于滤泡旁C细胞分化的甲状腺髓样癌，发病率约为5%，临床治愈率极低，极易发生局部或远处转移，如肝、肺、骨骼和脑等，手术治疗后极易复发[2]。近期的研究发现在一些人类癌症中存在肿瘤干细胞，这改变了关于致瘤和肿瘤治疗策略上的一些观点[3]。目前已经有研究证明肿瘤是由一些非正常细胞驱动发生的，这些细胞叫做肿瘤干细胞，它们对启动和维持肿瘤生长起着十分关键的作用。这些肿瘤始动细胞已经在一些人类肿瘤中得到了证实，如乳腺癌和结肠癌[4-5]。最近又有新的研究证实在甲状腺癌中也存在肿瘤干细胞[6]。正因为如此，鉴别和认识这种具有致瘤作用的肿瘤干细胞，对寻找和发现更多靶向的、有选择性的和个体化的治疗甲状腺癌的方法极其重要。

1甲状腺干细胞

研究发现甲状腺组织具有自我更新能力已经有很长一段时间了，然而直到最近才被认识到是因为存在成体干细胞才使它有这种自我更新能力。在成熟的甲状腺组织中存在甲状腺干细胞群是1992年被Dumont[7]证实的。他的实验是通过在小鼠模型内注入微小数量的这种细胞从而使甲状腺移植物在小鼠体内生长。这一发现又被Thomas在2006年得到更好地验证[8]。他在人甲状腺肿的甲状腺标本中检测到一群表达多能性的干细胞因子Oct-4，内胚层因子Gata-4和HNF4a，还有TTF和Pax8等因子的成体干细胞。不久，这一假设被Lan等[9]用实验证明。他从原代培养的甲状腺细胞中分离出甲状腺干细胞，而且在体外试验中证实了这种细胞有分化成甲状腺细胞的能力。已经有文献描述了几种类型的甲状腺干细胞：滤泡细胞的祖细胞起源于内胚层，C细胞的祖细胞起源于神经脊，还有一种是滤泡细胞和C细胞的共同祖细胞。这些不同类型的甲状腺干细胞都能通过基因突变而引发甲状腺肿瘤[10-11]。

传统的多级多阶段原因导致肿瘤发生的观点认为：甲状腺癌的发生是由于长期积累的甲状腺细胞基因组损伤，导致抑癌基因缺失或致癌基因激活从而发生肿瘤。根据这一观点，那么甲状腺细胞就能通过发生RAS和BRAF突变，或RET/PTC和Trk重排而发生状癌，也可以通过RAS基因点突变或PAX8/PPARγ重排而发生滤泡状癌。相反，未分化癌是通过分化型癌发生p53基因点突变而引起的[12]。

这种在分化型和未分化型肿瘤间发生基因组改变的多阶级致瘤假设的观点曾被Tallini质疑，因为他发现RET基因重排只发生在状癌而在未分化癌中没有发生[13]。另外，他们发现PAX8/PPARγ重排基因仅存在于滤泡状癌而在未分化癌从未被观察到[14]。最近的研究报道p53基因突变与未分化癌的高侵袭性密切相关，但是在其他类型的肿瘤中也有发现这一突变，甚至也发生在滤泡状癌中[12]。

以上这些发现说明如果按照这个多级致瘤假设理论分析甲状腺癌形成，那么就还有一些基因突变后的问题不能被解释。因此，近期又有一些研究提出了关于甲状腺肿瘤成因的另一个不同的观点：胎儿干细胞致癌假设理论。这一观点是根据肿瘤细胞是来源于胎儿甲状腺细胞的残留物，而且它有自我更新的能力，而不是来源于分化好的细胞。滤泡状癌、状癌和未分化癌被认为分别由前甲状腺细胞，甲状腺原始细胞和甲状腺干细胞的残留物产生而来。基因组的改变，包括RET/PTC和PAX8-PPARγ重排，以及BRAF基因突变都会影响胎儿甲状腺细胞分化而促进其增殖。尽管甲状腺干细胞代表着未分化癌的起源，但是它们也能促使前甲状腺细胞和甲状腺原始细胞产生。当甲状腺干细胞自己增殖时就会产生未分化癌，当其促使前甲状腺细胞和甲状腺原始细胞产生时，增殖的结果是产生分化型甲状腺癌。

2甲状腺肿瘤干细胞在甲状腺癌形成作用中的新观点

这种由肿瘤干细胞产生甲状腺癌的观点很早以前就由几个学者提出过[11-12]。然而直到最近发现甲状腺肿瘤干细胞的存在才被证实[6]。

在甲状腺肿瘤的研究中发现了肿瘤干细胞，最主要是因为发现了能鉴别这种细胞的相关分子标记。例如有研究已经发现CD133是一个能在未分化细胞系中识别干细胞群的分子标记[15]。2010年Todaro的研究数据表明并不是所有的上皮样甲状腺癌标本的肿瘤干细胞中都能发现CD133[6]。相反，有研究发现醛脱氢酶1（aldehydedehydrogenase1ALDH1）活性增加与乳腺癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤和肺癌的原发细胞有关[16-19]。

通过ALDEFLUOR试验在细胞分选过程中简单而精确地分析了有ALDH酶活性的甲状腺细胞的数量，结果表明三种不同组织学类型的甲状腺癌中未分化癌含有高表达ALDH的细胞比例最高，也许这与它的高恶性程度有关。同时，未分化癌中这种高表达ALDH的细胞与其他正常组织比具有更高的增殖能力，或者说自我更新能力。为了分析未分化癌中这种细胞是否保持有启动肿瘤生长的能力和了解其肿瘤的临床或病理学特点，例如其高侵袭性等，从状癌、滤泡状癌和未分化癌中分离出高表达ALDH的细胞，然后将其注入免疫功能不全的小鼠模型中。结果显示：在甲状腺状癌的小鼠模型中注入了高表达ALDH的细胞后发现肿瘤只在局部生长，而在甲状腺滤泡状癌的小鼠模型中注入了高表达ALDH的细胞后发现肿瘤渗透生长并压迫局部组织，例如压迫喉和气管。此外，在活体的未分化癌患者的全身影像学分析发现这种由高表达ALDH的细胞导致的肿瘤有一个高发的肺转移率。与相应的亲代肿瘤相比，移植后肿瘤的ALDH1、肌酸激酶19、甲状腺球蛋白的表达和肿瘤细胞数目都没有明显的变化，这就说明移植后的甲状腺肿瘤保持着与亲代肿瘤一样的恶性程度。

要描述这种甲状腺移植瘤的生长特性包括：能导致肿瘤生长和侵袭的特定的基因型改变，肿瘤生长的方式和有利于前期临床的靶向治疗方法。在对甲状腺肿瘤干细胞的基因转录程序的研究中发现：肿瘤干细胞潜在的致瘤性和高侵袭性与Met/Akt信号通路有关[6]。事实上，Todaro的研究已经发现如果激活Met、Akt和β连环蛋白，并且下调E钙黏蛋白就能导致一个发生肿瘤的表型，这也是形成未分化癌干细胞的主要因素。有趣的是，如果沉默Met或Akt能抑制描述上皮间质转化的两个关键转录因子Twist和Snail的表达，同时减弱未分化癌干细胞的转移和侵袭能力。这个关于Met/Akt信号能减弱甲状腺癌侵袭能力的观点在体内试验也得到了证实。将沉默了Met和Akt的未分化癌细胞转入小鼠的甲状腺组织中，之后用光子成像分析检测发现沉默Met和Akt能将甲状腺肿瘤干细胞的潜在侵袭能力基本彻底消除[6]。

其他许多团队则致力于研究激活PI3K/Akt信号通路是否能影响甲状腺癌的发生和进展，或潜在的治疗靶点。早在2009年国内就有研究者发现用特异的Akt信号抑制剂（哌立福辛）能阻断甲状腺癌细胞的增殖并促进其凋亡，这是通过激活PI3K/Akt信号通路并改变其基因型而实现的。西罗莫司类药物，是参与甲状腺细胞增殖调控过程中的一类丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶物质，与Akt信号抑制剂一样起着肯定的治疗肿瘤的作用[20]。

3甲状腺癌治疗中的新策略

临床上治疗甲状腺癌的方法在最近二十年内都保持不变：状癌或滤泡状癌患者在外科手术后再接受一定剂量的放射碘治疗，用以破坏手术不能完全清除的少量癌细胞。另外，未分化癌的恶性程度很高，临床预后很差，这种肿瘤生长迅速，局部浸润易发，而且对放疗或化疗的效果很差，主要是因为缺乏摄碘受体[6]。

随着对甲状腺肿瘤发病机理的深入研究，人们可能会发现更多的新方法来治疗这些目前疗效不满意的肿瘤。之前已经有文献报道，甲状腺癌对化疗诱导的细胞程序性死亡方法抵抗就可能跟自分泌白介素4和白介素10有关，而这个过程是通过上调抗凋亡分子cFLIP，Bcl-xL和PED实现的[21-22]。随后，又有学者发现在未分化癌中，残留细胞的增殖能力和对死亡的耐受程度似乎与细胞因子信号抑制基因（suppressorscytokinesignalingSOCS）的表达有关，它是通过下调Akt信号而影响Bcl-2家族蛋白的表达。在体内和体外试验中发现外源性表达SOCS-3和SOCS-5能减弱肿瘤的生长并明显提高化疗的效果，这是通过改变细胞凋亡和抗凋亡分子间的平衡而实现的。这些结果就说明SOCS调控细胞因子程序凋亡可能会是治疗高度恶性甲状腺癌过程中克服其抵抗化疗问题的一个新策略[23]。

甲状腺肿瘤干细胞是研究领域中一个惊喜的发现，它将为甲状腺癌的诊断和治疗提供很多重要的新线索。如果肿瘤干细胞有无限的自我更新和分化能力，那么这将是化疗中要克服的最主要的问题。目前治疗甲状腺癌的方法（手术、放疗、化疗）都能迅速杀灭已分化的癌细胞，但仍有少数静止的潜在肿瘤细胞被存留下来。最理想的治疗方法应是在杀灭已分化细胞的同时也要将潜在突变的肿瘤干细胞破坏掉。

尽管这种针对肿瘤干细胞的理想药物似乎很令人兴奋，但它也不是这么容易实现。肿瘤干细胞能通过多种机制逃避药物诱导的细胞死亡信号，包括上调ATP结合转运蛋白，激活DNA的修复能力和过表达抗凋亡分子。关于这点，鉴别甲状腺肿瘤始动细胞能够为在肿瘤干细胞的自我更新和化疗药物抵抗方面的研究中提供强有力的工具去更好地了解特殊基因和信号转导通路，例如Wnt/β连环蛋白通路。未分化甲状腺癌中激活这条通路似乎与抗肿瘤药的疗效有关，如单用选择性络氨酸激酶抑制剂（甲磺酸伊玛替尼）治疗就无效，尽管它是以β连环蛋白为靶分子，而且能够降低甲状腺肿瘤细胞的侵袭和增殖能力[15]。

有几种药物已经在试验中被研究。他们包括络氨酸激酶抑制剂，如和RET/PTC或RET信号通路有关的吡唑嘧啶PP2和Wnt/β连环蛋白通路有关的伊马替尼，还有激活PPARγ信号的噻唑烷二酮类等[24-27]。将来的挑战就是要发现新的特异的抑制剂去对抗最新在甲状腺状癌中发现的致癌基因BRAF和未分化癌中PI3K的激活[28-29]。关于高侵袭性的甲状腺髓样癌，最新的研究发现在体内或体外试验中有针对RET和FGF受体的特殊药物能抑制肿瘤的生长，这就说明有联合基因和药理学方法对治疗起有效作用[2]。

4展望

本文着重叙述了甲状腺肿瘤干细胞研究中的一些最新发现和成果，特别是未来治疗策略上存在的一些新挑战。全面而深刻地描述肿瘤始动细胞将有助于了解其在肿瘤发生中的潜在作用，也能明确目前抗肿瘤药物治疗中存在抵抗性或耐药性的一些可能机制。此外，这些细胞也能用于构造动物试验模型来进行活体内研究介导甲状腺肿瘤发生的分子事件，以及更好地研究和发现个体化治疗甲状腺癌的方案或敏感药物，这对于高恶性和高侵袭性的肿瘤来说极为重要。

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细胞生物学研究篇5

【关键词】红斑狼疮；系统性；骨髓间充质干细胞；生物学特性

骨髓间充质干细胞(MarrowMesenchymalStemCells，MSC)具有高度自我更新和多向分化的潜能，并具有支持造血和免疫负调节作用［1］。大量的体外细胞培养实验［2,3］证明它具有诱导免疫耐受和免疫抑制的特性。MSC移植在SLE治疗中具有较广阔的应用前景。了解SLE患者自身MSC是否异常是判断选择自体或异体MSC移植治疗SLE的重要依据。SLE患者MSC的体外扩增及其生物学特性是协助我们评价SLE患者MSC是否存在缺陷的重要方面。

1资料与方法

1.1一般资料9例SLE患者均符合1997年美国风湿病学会修订的SLE分类诊断标准，SLE疾病活动评分(SLEDAI)判断疾病的活动程度。9例患者的资料见表1。另选5例性别、年龄匹配的健康者作为对照组。

1.2骨髓MSC分离培养采用羟基淀粉沉淀联合Ficoll密度梯度离心法和贴壁筛选法分离培养MSC。具体方法无菌操作下抽取骨髓液10ml，以5×105U/ml肝素钠抗凝，先用羟基淀粉按1∶4体积加入，静置20min，通过自然沉降去除下沉的大量红细胞，剩余的含大量红细胞的下层液体，再用淋巴细胞分离FicollHypaque常规分离单个核细胞。将上述两步分离所得的骨髓单个核细胞充分混匀，悬浮于体积分数为10％的胎牛血清DMEMLG培养液中，按约1×106/ml密度接种于25cm2培养瓶，置37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度的培养箱中。当显微镜下观察细胞已达90%融合时，则可传代。用0.5%胰酶/乙二胺四乙酸(EDTA)(Gibco，美国)消化贴壁细胞，收集细胞并悬浮于完全培养液中，按104/cm2的密度接种于新的培养瓶中，置37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养，每3~4天更换1次培养液，约1周待细胞生长密度达90%左右时，进行再次传代。

1.3MTT法检测MSC的生长情况MTT比色法检测SLE患者第2代MSC的生长情况，作传代细胞培养的生长曲线分析。

1.4流式细胞术检测MSC表面分子的表达细胞培养扩增到第三代时，分别取100ul细胞悬液与鼠抗人CD29、CD44、CD34、CD45抗体室温反应30min。流式细胞仪检测。

2结果

2.1MSC的传代情况及形态

本实验进行了9例SLE患者和5例健康对照者MSC体外培养。5例健康对照者MSC均能成功体外扩增。9例患者中，5例MSC能传代扩增，传代率为55.6%。其中女性4例，男性1例，年龄16~26岁，平均年龄21.8岁；病程3~24月，平均病程9.8月；DAI评分为15~21，平均评分为18.6。5例SLE患者均合并有肾损害，其中1例合并有血液系统损害。MSC体外扩增不成功的4例SLE患者，均为女性，年龄26~45岁，平均年龄38.2岁；病程6~60月，平均病程37.5月；DAI评分为1322，平均评分为18.5。4例SLE患者均合并有肾损害，其中2例合并有严重血液系统损害。每例患者的临床资料及MSC体外培养基本情况见表1。

2.1.1体外扩增成功者5例MSC体外扩增成功的SLE患者，MSC生长情况与健康对照组相比较：原代培养时，细胞形态上与健康对照组相似，但纺锤形、梭形细胞的出现稍晚，一般于2~4d，健康对照组的一般出现于1~2d内；随后逐渐见集落形成，原代培养的时间平均为(14.2±1.45)d，与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，细胞呈长梭形旋涡样生长；传代后细胞生长较旺盛，平均传代时间(5.8±0.44)d，与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。消化传代的细胞于24h内完全贴壁，形态与健康对照组相似。

2.1.2体外扩增不成功者MSC生长情况与健康对照组相比较：同等骨髓量分离得到的单个核细胞数量与健康对照组相比明显减少，且贴壁的纺锤形、梭形细胞的出现时间明显较晚，一般于6~7d，且仅零星分布，不成集落生长，随着培养时间的延长，其中2例可见细胞少量扩增，培养至第15天，约见20％~30％融合的短梭形细胞生长(图3)，至第30天，细胞基本自行凋亡；另2例至第18天，见部分长梭形细胞零星分布，融合少于10％，至第30天细胞基本自行凋亡。

2.2MSC表面分子的表达

流式细胞术检测BMMSC细胞表面抗原，结果显示体外扩增成功的SLE患者BMMSC均高表达CD29、CD44，而不表达CD34、CD45，第3代BMMSC纯度达95%以上，且各表面标志的表达与健康对照组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3MSC的生长情况

SLE患者第2代MSC生长趋势与健康对照组相似，第3~4天生长活跃，第4天后生长渐缓，第56进入生长平台期。

3讨论

MSC是骨髓中具有高度自我更新和多向分化潜能的一群干细胞，体外培养易纯化、扩增迅速，具有支持造血、免疫调节和诱导免疫耐受的作用。本实验进行了9例SLE患者和5例健康对照者MSC的体外培养。健康对照者MSC均能成功体外扩增。9例SLE患者中，5例可以传代扩增，传代率为55.6%。有4例SLE患者MSC不能成功传代扩增，说明部分SLE患者MSC存在缺陷。另一方面，我们发现能成功传代的5例SLE患者MSC无论是从细胞形态、原代培养所需时间、平均传代时间及表面特异性分子表达均与健康对照组无明显差异，所培养、扩增的细胞能达到临床应用的要求。提示这部分SLE患者MSC生物学特性基本正常。

对两组扩增情况不同的SLE患者的临床资料进行比较，我们发现未能成功体外扩增的SLE患者具有如下的临床特征：①年龄较大。②病程较长。③合并有较严重的血液系统损害。④长期大剂量应用免疫抑制剂。

大量实验发现，MSC的生物学特性与年龄密切相关。骨髓中MSC的含量、质量以及细胞活性随着年龄的增长而下降［4,5］。骨髓中MSC的克隆数随着年龄的增长而逐渐减少，且BMMSC分泌SCF、FLT3L、IL6、TGFβ1及SDF1等与自我更新密切相关的细胞因子的能力逐渐下降，导致BMMSC的增殖能力逐渐减弱。另外，也有研究者指出［6］，病情较重的SLE患者，从骨髓中可提取的单个核细胞数原本就较少，所含MSC就更少。然而SLE病情轻重、病程长短及不同药物治疗是否会影响SLE患者MSC的体外扩增、生物学特性及功能，目前尚未能明确。

我们实验说明SLE患者MSC存在一定的异质性，因此应用MSC治疗SLE前，了解患者自身MSC是否存在缺陷是必需的。如果患者MSC本身存在缺陷，为避免治疗失败或复发，异体MSC输注为首选；如果MSC本身基本正常，自体MSC输注将是有效的。SLE患者MSC的体外扩增及其生长特性是协助我们评价SLE患者MSC是否存在缺陷的重要方面，为SLE患者MSC移植的治疗方法提供了理论依据。

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细胞生物学研究篇6

[摘要]目的：了解体外培养的人脂肪问充质干细胞的生物学特性及其体外成脂和成骨的能力。方法：体外培养人脂肪间充质干细胞并传代计数，行成骨和成脂诱导，流式细胞仪检测其细胞增殖周期与表面分子。结果：人脂肪干细胞经过体外培养均一的阳性表达CD44、CDl06，而CD49d、CD34、CD45和HLA―DR表达阴性。细胞周期分析表明：G0／G1、s和G2／M所占比例分别为79．1％、19．7％和1．3％。分离细胞在诱导体系下可以向成骨和戍脂方向分化。结论：脂肪间充质干细胞具有特殊的生物学特点，体外能够向成骨和成脂方向分化。

[关键词]脂肪间充质干细胞；分化；脂肪细胞；成骨细胞

[中图分类号]Q813．1[文献标识码]A[文章编号]1008―6455(2007)02―0159－03

间充质干细胞最初由Friedensrein等Ⅲ发现，其广泛分布于肌肉、血管、胰腺和脂肪等组织中，而且证实在体外可以分化为成骨细胞和成脂细胞。其中脂肪来源的间充质干细胞取材方便，痛苦小，在细胞治疗和组织工程方面有广阔的前景因而日益引起研究者的重视。本研究通过分离脂肪组织的间充质干细胞，研究其生物学特性及体外成脂及成骨的能力，为其作为组织工程的种子细胞提供理论依据。

1材料和方法

1．1材料与试剂

1．1．1细胞培养体系：MEM培养基(GIBC0)，10％胎牛血清(兰州明海生物公司)，100IU／L青、链霉素。

1．1．2细胞表面分子鉴定相关试剂：CD44、CD49d、CD34、CD45、CDl06和HLA-DR(鼠抗人cALTAG)FITC(羊抗鼠ZYMED)

1．1．3细胞周期测定相关试剂：RNaseA(TakaRa)、碘化丙啶(PI，Sigma)。

1．1．4其他试剂：胰酶、地塞米松、β－甘油磷酸钠、维生素C、胰岛素、卜甲基3－异丁基一黄嘌呤、吲哚美辛、胶原酶I(sigma)。

1．2方法

1．2．1脂肪间充质干细胞的分离纯化与培养：脂肪组织来源于兰州军区兰州总医院美容中心行脂肪抽吸术的患者，身体健康，无任何疾病。无菌条件下，在局部肿胀麻醉下采用注射器法抽取50ml颗粒脂肪组织，静置30min，去除上清液体，获得纯度较高的脂肪颗粒，用等容的D―Hank’s平衡盐液清洗4次，去除细胞碎片。然后用150mlHBSS(含0．075％胶原酶I)，在37℃，振动消化lh。胶原酶I的活性用等量的MEM(含10％的胎牛血清)中和之后离心1200r，lOmin。细胞被悬浮在MEM(含10％的胎牛血清)用100目筛网过滤。离心后，细胞重悬于MEM培养液，添加至培养皿，37℃，C02孵箱中培养24h，未贴壁的细胞和残渣被除掉，添加新鲜培养液于贴壁细胞。细胞培养至80％融合时，用胰酶／EDTA消化和按1：1的比例传代。

1．2．2细胞形态学观察：细胞接种后每次换液时用相差显微镜观测细胞生长与形态变化，并分别于细胞接种后24h、10天、2周时摄相记录。在培养皿里加入盖玻片，待细胞爬满后经过PBS清洗后，固定行油红0染色。

1．2．3细胞表面分子测定：取传第二代以后的细胞用于以下实验，操作步骤如下：

培养的脂肪干细胞经过消化离心(1000r／min，5min)后细胞重悬；细胞计数后将细胞浓度调整为l×108／L，分别于人抗CD34、CD44、CD45、CEl06、CD49d和HLA-DR单克隆抗体室温反应30min，PBS洗涤2次后于FITC标记的二抗避光作用30min。用PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测。

1．2．4细胞周期的测定：培养的脂肪干细胞经过消化离心(1000r／min，5min)，调整细胞浓度至1×108／L，用70％的冰乙醇固定24h，RNaseA处理30min，PI染色lOmin。用Cellquest软件获取10000个细胞，ModiFit分析细胞周期。

1．2．5细胞的油红0染色：先将培养皿中的培养液倒掉，并用PBS洗1～2遍，然后加入10％福尔马林固定30min以上，倒固定液，用60％异丙醇浸泡30min，换油红O染液1h，倒染液，60％异丙醇涮洗1次(5s)，自来水冲洗2～3min，换福尔马林观察并照相保存。

1．2．6脂肪间充质干细胞的成骨诱导：取传2代细胞，以l×108／cm2的浓度接种与2个6孔板中。当细胞贴壁生长达80％汇合时，每孔加入等量的成骨诱导试剂：含地塞米松(10-7mol／L)、B一甘油磷酸钠(10mmol／L)、维生素C(50mg/L)，放入C02孵箱培养，2～3天换液。分别于细胞培养1、2周时吸出每组培养液，PBS洗2次，消化并离心，用MEM重悬细胞，然后离心涂片，行ALP染色。

1．2．7脂肪间充质干细胞的成脂诱导：取传2代细胞，以l×108／cm2的浓度接种与2个6孔板中。当细胞贴壁生长达80％汇合时，每孔加入等量的成脂诱导试剂：含lmol／L地塞米松、lOtxg／ml胰岛素，0．5mmol／L1一甲基3一异丁基一黄嘌呤，1001xmol／1吲哚美辛。对照组加常规培养液。每3～4天换液。3周后行油红O染色。

2结果

2．1倒置相差显微镜观察：接种后24h，极少数细胞贴壁，呈梭形，4天后细胞呈纤维集落样生长，大约10天，细胞迅速生长并形成克隆，2周左右细胞近80％～90％汇合，出现致密的贴壁层。继续培养，可见有自发分化的现象出现不典型的聚集的小脂泡。油红0染色证实为脂肪，见图l。分别为接种后24h，4天，2周，自发成脂分化的细胞。

2．2脂肪问充质干细胞表面抗原分子测定：流式细胞仪检测结果显示：脂肪间充质干细胞均．的表达CD44,CDl06阳性，而CD34,CD45、CD49d和HLA―DR呈阴性表达。CD49d和CDl06是脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的很好的区分标记，见图2。

2．3脂肪问充质干细胞的细胞增殖周期：取3代细胞经过流式细胞仪分析表明：G0。／G1、s、G2／M的细胞所占的比例为79．1％、19．7％、1．3％。结果显示：我们分离培养的细胞处于G0／G1期，仅少数细胞处于活跃的增殖期，

2．4细胞ALP染色：第3代细胞在体外进行成骨诱导时ALP阳性率较未诱导组明显提高，见图3。说明干细胞在成骨诱导体系下向成骨细胞分化。2．5细胞的油红0染色：第3代细胞在体外进行成脂诱导时阳性率较未诱导组明显提高，见图4。说明脂肪间充质干细胞在成脂诱导体系下向脂肪细胞分化。

3讨论

近年来骨髓间充质干细胞是研究的热点，考虑到脂肪组织和骨髓同为中胚层起源的组织，是否具有多向分化潜能，在实验中我们使用从脂肪抽吸术中获取的脂肪颗粒，而没有像其他文献中使用腹部或取深层脂肪，其方法简单，减轻供者的痛苦，并且肿胀麻醉使用的利多卡因和肾上腺素经过洗涤可除去，不会对其生物学特性产生影响。在现有的实验方法中，为排除红细胞的干扰，常使用NH4CL破坏红细胞。鉴于红细胞不贴壁的特性，我们通过换液的方法去除红细胞，取得很好的效果，2次换液后，红细胞基本消失，而且减轻了NH4CL对脂肪干细胞的损伤。

众所周知，骨髓问充质干细胞无特异的表面标志，而DeUgarte等在一个病人身上分别取骨髓和脂肪组织，并对二者进行了比较，初步证明在生长方式、多向分化潜能和细胞表面标记无显著的差异。本研究测定CD34、CD45、CD49d和HLA-DR阴性，CD44、CDl06阳性。CD49d和CDl06是脂肪问充质干细胞和骨髓间充质干细胞的很好的区分标记。HLA-DR是成纤维细胞的表面标记，CD34、CD45是造血干细胞的表面标记，通过它们我们可以认为培养细胞为排除了成纤维细胞的干细胞，HLA-DR阴性也可以为脂肪问充质干细胞的自体或同种异体移植提供理论依据。

细胞周期检测显示贴壁细胞中的G0／G1、S、G2／M的细胞所占的比例为79．1％、19．7％和1．3％。说明绝大部分细胞处于静止态，但保留自我更新和增殖能力，少部分处于功能态，这符合干细胞的特性，该结果也支持培养的贴壁细胞为问充质干细胞。本研究分别使用了诱导剂使其向成骨和成脂方向分化。地塞米松作为两者的诱导剂，它依赖于使用剂量和作用时间的差异，在低浓度时表达为成骨细胞，而高浓度时则与胰岛素共同作用激活糖皮质激素受体，继而启动PPARr，在转录水平激活脂肪细胞基因使其分化为脂肪细胞。由此推测成骨和成脂之间是否有某种关联，值得进一步研究。另外本研究还发现在无血清和低血清的条件下，诱导明显好于10％胎牛血清，但增殖速度明显减慢。

脂肪间充质干细胞与其它干细胞相比，具有显著的优越性，它容易获取，对患者的痛苦小，并且在脂肪抽吸术中获取脂肪还可以达到变废为宝的目的。其次这种细胞在体外增殖快，平均倍增时间为16h，不必进行永生化就能获取足够的细胞进行移植。人来源的脂肪间充质干细胞能够进行自体移植，可以克服免疫排斥。因此有望成为脂肪组织工程和基因治疗的一种很好的细胞来源。