医学遗传学系谱分析篇1

[关键词]串联质谱；新生儿筛查；氨基酸；酰基肉碱；室间质评

[中图分类号]R446.1[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2014）07（b）-0024-05

自1963年利用枯草杆菌抑制试验进行新生儿苯丙酮尿症的筛查以来[1]，经过40多年的发展，新生儿筛查的概念被普遍认可；筛查技术越来越先进，筛查的方法也越来越灵敏、可靠。我国新生儿筛查工作起步较晚，自1980年代起开始进行遗传代谢病的新生儿筛查，1995年将新生儿筛查工作纳入母婴保健法，使开展新生儿筛查工作有了根本保障。但是筛查的病种有限，主要为苯丙酮尿症和先天性甲状腺功能减退症，纳入遗传代谢病较多依赖生化与分子生物学方法，对技术和设备的要求较高，往往是临床诊治难点。随着人类疾病谱的改变和对出生缺陷的重视，近年国际上开展的串联质谱技术检测病种多，可在2min内检测出45种遗传代谢病，适合大规模遗传代谢病筛查和临床疑似患儿的诊断性检测[2-4]。目前我国越来越多的实验室使用串联质谱开展新生儿筛查工作。鉴于此，卫生部临床检验中心选取了部分开展新生儿筛查的实验室对新生儿遗传代谢病串联质谱检测氨基酸和酰基肉碱项目进行室间质量评价调查。

1对象与方法

1.1室间质量调查对象

2013年选取开展新生儿筛查的实验室19家，为三甲综合医院医院和三甲专科医院临床实验室。

1.2室间质控品的递送和批号

通过特快专递方式向19家实验室邮寄5个不同批号血斑质控品。质控品由杭州宝荣公司提供，批号分别为201311、201312、201313、201314、201315。

1.3样本处理方法及回报结果注意事项

质评物需在2～8℃条件下保存，将质评物当作患者标本进行测定，结果填入对应批号回报表中。回报结果的同时填报使用的测定方法、仪器和试剂名称。

1.4评价项目

氨基酸包括瓜氨酸（Cit）、亮氨酸（Leu）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）和缬氨酸（Val）；酰基肉碱包括游离肉碱（C0）、丙酰肉碱（C3）、异戊酰肉碱（C5）、辛酰肉碱（C8）、月桂酰肉碱（C12）、棕榈酰肉碱（C16）、十八碳酰肉碱（C18）。

1.5评价标准

2013年参加新生儿遗传代谢病串联质谱氨基酸和酰基肉碱检测项目调查的实验室共19家，实际回报结果的单位为18家，有1家实验室因质控品丢失未回报结果，回报率为94.7%。回报结果按方法学原理（衍生方法和非衍生方法）同时考虑是否是配套试剂分组，以分组后除外x±3s后的中位数作为靶值[5-6]。氨基酸项目评价标准：靶值±25%；酰基肉碱项目评价标准：靶值±30%。

2结果

2.1氨基酸和酰基肉碱结果

选取高、中、低浓度的3个批号（201311、201313、201315）分别按照方法学原理同时考虑是否配套试剂分组统计见表1、2。

氨基酸项目按方法分组的统计结果，18家回报结果的实验室有14家实验室采用衍生方法不配套的试剂盒，有3家采用衍生方法配套的试剂盒，只有1家实验室采用非衍生的方法。其中，瓜氨基酸项目的变异系数分布在1.52%～25.01%；亮氨酸项目的变异系数分布在2.93%～24.66%；甲硫氨酸项目的变异系数分布在7.83%～43.00%；苯丙氨酸项目的变异系数分布在1.68%～29.67%；酪氨酸项目的变异系数分布在1.60%～35.09%；缬氨酸项目的变异系数分布在6.62%～52.18%。数据显示实验室检测氨基酸一致性好变异系数基本在40%内。

酰基肉碱的统计结果可以看出，18家实验室中有14家实验室采用衍生非配套的试剂检测酰基肉碱，有3家实验室采用衍生配套的试剂检测酰基肉碱，有1家实验室采用非衍生的方法检测酰基肉碱。其中，游离肉碱项目变异系数分布在4.31%～61.40%；丙酰肉碱项目变异系数分布在5.31%～78.69%；异戊酰肉碱项目变异系数分布在16.29%～64.29%；辛酰肉碱项目变异系数分布在4.81%～80.00%；月桂酰肉碱项目变异系数分布在8.12%～55.56%；棕榈酰肉碱项目变异系数分布在5.75%～34.78%；十八碳酰肉碱项目变异系数分布在3.64%～19.17%。数据显示实验室检测酰基肉碱的一致性不好。

2.2按方法学分组计算各组及格率

以项目的中位数为靶值，测定值在靶值±30%内判定为及格。氨基酸项目及格率统计结果中瓜氨酸项目及格率为71.4%～100.0%，亮氨酸项目的及格率为71.4%～100.0%，甲硫氨酸项目的及格率为42.5%～100.0%，苯丙氨酸项目及格率为71.4%～100.0%，酪氨酸项目及格率为71.4%～100.0%，缬氨酸项目的及格率为66.7%～100.0%。酰基肉碱及格率统计结果中游离肉碱项目的及格率为42.9%～100.0%，丙酰肉碱项目的及格率为28.6%～100.0%，异戊酰肉碱项目的及格率为33.3%～92.9%，辛酰肉碱项目的及格率为28.6%～100.0%，月桂酰肉碱项目的及格率为46.2%～100.0%，棕榈酰肉碱项目的及格率为64.3%～100.0%，十八碳酰肉碱项目的及格率为71.4%～100.0%。结果表明，各氨基酸项目成绩好于酰基肉碱结果的成绩。

3讨论

从调查结果看出，串联质谱检测氨基酸和酰基肉碱大都采用衍生的方法，同时大部分的实验室都没有使用配套的试剂，从本次调查结果看使用配套试剂的3家实验室变异系数较小，但是由于配套试剂的实验室数较少，所以不能说明配套试剂比非配套试剂检测结果更具有一致性。结果还能看出，氨基酸检测结果的一致性比酰基肉碱好，及格率较高，这可能与建立的方法有关。MS/MS与以前大多数筛查实验室所采用的系统是完全不同的技术。它具有多种用途、较复杂的系统，基于疾病筛查的特殊性建立方法时应该注意3个方面[7-9]：①方法的确认，主要是对本室建立的方法进行特异性、重复性、精密度和准确性、线性、干扰实验、基质效应考核。②性能验证，建立方法并确认后，可取一定数量已知含量的样本进行分析，验证方法的准确性，或者通过比对实验来考核。③建立并确认截断值。通过分析正常患者的干血斑标本建立分析物的截断值，同时必须考虑方法和仪器的参数以及可接受的假阳性结果的数量。

串联质谱检测在遗传代谢病筛查的应用具有很重要的社会效益和经济效益，一次性检测30～50种氨基酸、有机酸、脂肪酸代谢病等多种疾病，其科学性、临床价值和社会意义有目共睹，而质量控制方面还有待提高。为了保证检验结果一致性，实验室需要做好室内质量控制[10-13]：使用前需优化串联质谱仪自身参数，使其具有较高的分辨率和灵敏度；长时间的关机开机，离子源的喷雾针及进样孔容易堵塞，需要定期检测调试；样品的处理过程也会对检验结果产生很大的影响，比如内标试剂的配制及每次样品吹干时的气流，氨基酸较难溶于甲醇，配制时需超声足够的时间，衍生化的过程可能会导致某些代谢物或内标的降解（如谷氨酰胺脱氨基转化为谷氨酸）；另外，良好的实验环境、严格的实验室管理制度保证工作人员各司其职、重视预防性质控（如优选试验方法、建立操作规程、仪器的调式和校正、试剂的标定、标本的正确处理、遵章操作、准确计算、做好实验记录等）、重视工作人员的业务培训和考核等也有利于保证结果的准确。

我国疆域辽阔，地域发展不平衡，实验室的质量控制水平也参差不齐，目前部分发达地区的实验室参加美国CDC的室间质评，并且加强对实验室管理，而一些实验室则只关注新技术新方法却缺乏相关质量控制知识并且未开展实验室间的比对。另一方面，卫生部临床检验中心计划增加串联质谱检测氨基酸和酰基肉碱的室间质评项目，此举无疑会提高我国遗传代谢病的研究领域整体水平。

[参考文献]

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医学遗传学系谱分析篇2

以单核苷酸多态性（SNP）为核心的DNA分子标记：SNP是基因组中单个碱基缺失和插入，单个核苷酸的颠换产生的差异。SNP位点几乎遍布于整个基因组；其遗传稳定性高，易于进行自动化分析。

SNP在种群中是二等位基因性的，部分SNP可能会直接影响蛋白质的结构或基因表达水平。对于SNP的检测可以通过经典的凝胶电泳法以及高通量的检测方法如，DNA测序法、DNA芯片检测、飞行质谱仪检测、变性高效液相色谱法等。Westen等和Mead等的实验结果均表明，对于腐败降解的检材，SNP的DNA分析结果较STR的分析结果好。

用于法医学的DNA分子标记技术

1常染色体分析：随着复合荧光标记技术以及自动分型仪器的使用，使得工作者能从少量的DNA检材中获得遗传信息，STR－PCR分析已经成为法医DNA检验中的主要技术手段。人体基因组中含有高变区，这些高变区是一些串联重复序列。STR广泛存在于真核生物基因组中，其核心序列为2～6bp，重复次数通常在5～40之间。STR具有多态性高，操作简单、检测灵敏度高等优点。自20世纪末STRs商业试剂盒投入生产并广泛使用以来，大批商业试剂盒，都包含有15～16个高多样性的STR基因座，例如PowerPlexRESX、ESI系统、AmpFlSTRRNGM，这些试剂盒在引物设计，缓冲液成分、扩增条件，提高痕量样本的分析等方面进行了改进。同时商业试剂也在处理降解DNA和痕量DNA方面进行改进，例如减少旁侧区的扩增长度，增加核心位点，如miniSTR，以适合更多痕量检材的检测。

2性染色体分析：对于常染色分析受限的检材，性染色体STR为法医个体识别和亲权鉴定提供了新途径。Y染色体由父亲直接遗传给儿子，大部分Y染色体不发生重组，后代遗传变异小，在男性组织成分的个体识别和父系家族的亲权鉴定中具有独特的应用价值。Thomas等利用电离飞行时间质谱分析了来自不同种族的16个Y－STR基因座，结果可行。由于Y－STR的局限性，在应用Y－STR进行家系调查时应注意应用的范围，排查前要收集族谱，明确家庭间的遗传关系。X－STR对于双亲缺乏的同父异母姐妹亲缘关系认定、涉及父女关系的单亲亲权鉴定等方面案件有特殊作用。X染色体在遗传过程中为性连锁遗传，在X－STR的应用中应注意连锁不平衡和单倍体等问题。单个STR基因座能提供的信息量有限，主要依靠X－STR复合扩增体系。畅晶晶等通过中国华东地区汉族人群200个无关个体的调查建立遗传学资料，筛选出了48个位点分型结果稳定、重复性好的X－SNP位点。

医学遗传学系谱分析篇3

摘要单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性。SNP现象在人类基因组中广泛存在，并具有很高的信息含量。目前已发现数万个SNP标记，且有多个生物医学网站开辟了专页对其加以介绍。随着对SNP检测和分析技术的进一步发展，尤其是与DNA芯片等技术的结合，它已成为第三代遗传标记，初步满足对疾病相关基因定位研究的需要，尤其是对多基因遗传病高精度基因定位的要求，并将最终取代目前最常用的微卫星标记技术进入基因应用研究的领域。

SNP单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。

理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换(C?T，在其互补链上则为G?A)，也可能是颠换(C?A，G?T，C?G，A?T)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。Wang等［1］的研究也证明了这一点。转换的几率之所以高，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(codingsNP,cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5［2，3］。但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。

从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP(synonymouscSNP),即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP(non-synonymouscSNP),指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中约有一半为非同义cSNP。

先形成的SNP在人群中常有更高的频率，后形成的SNP所占的比率较低。各地各民族人群定SNP并非一定都存在，其所占比率也不尽相同，但大约有85%应是共通的［4］。

SNP检测方法目前已有多种方法可用于SNP检测，如根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。

传统的SNP检测方法是采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等。这些技术虽在某种程度上能完成对SNP的检测，但由于它们必须通过凝胶电泳进行检测，因此，距快速、高效、自动化的目标还相差甚远。传统的RFLP只能检测到SNP的一部分，测序技术既费时费力，又不易实现自动化，而且DNA链的二级结构还容易造成人工假相，使测序结果出现偏差，不适宜于SNP的检测；SSCP则很难满足自动化的需要，难以大规模开展工作。因此，这些方法均未被广泛采用。

DNA芯片技术是近年来新开发的一种DNA序列变异检测工具。DNA芯片(DNAchip),也称生物芯片(biochip),其大小与计算机上的CPU芯片相似，约1cm2或更大些，以玻璃、硅、聚丙烯等作为载体基片，芯片上铺了一层肉眼看不见的DNA纤维“地毯”，即具有特定碱基序列的探针。待测基因经提取后，被切成长短不一的片段，经荧光化学物质标记后，注射到嵌有芯片的载片上。由于DNA和探针杂交的程度与荧光强度相关，因此通过激光扫描，即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。

目前已有多家公司开展了对芯片的研究，例如美国的Affymetrix公司、NEN生命科学公司等。前者曾开发出BRCA1(乳癌基因1号)芯片、p53芯片等，后者则在1张玻璃芯片上集成了多达2400个已知基因。此外，ResearchGenetics公司新近开发了1个集成有1500个SNP的DNA芯片，它涵盖了人类基因组全部24条染色体，所提供的信息量至少等于或优于目前常用的300～400个微卫星标记的图谱，检测时只需0.5μg的DNA样品就可进行1次全基因组的扫描。

SNP研究进展和信息搜寻SNP研究是目前人类基因组研究的又一个热点，1998年Wang等［1］首先报道了根据SNP技术建立的人类遗传图谱，其获得的SNP平均距离为2cM(centimorgan);Cho等［5］则在模式生物拟南芥(Arabidopsisthaliana)上作了全基因组的SNP图谱定位，该图谱中SNP平均距离为3.5cM。所有这些SNP数据均可为公众免费获取。目前，不仅在人类染色体上，而且在其它生物的基因组上也已建立了SNP图谱。美国、西欧及日本等国的政府、科研机构及部分私人公司斥巨资研究开发的SNP图谱也将向公众免费提供。

近年来，储存在公共数据库里的SNP数量正在以几何级数迅速增长。1999年4月，总共才分析了7000个SNP，其中cSNP占半数；而到了当年12月16日，仅美国的国立生物技术信息中心(NCBI)的SNP数据库就已存放了21172条SNP至1999年10月10日德国的HGBASE网站也已存放了6503条SNP。

目前已有许多生物医学网站开辟了专门的SNP网页，人们可以很方便地在这些网站上查阅有关的SNP信息。国际上较重要的网站有：(1)dbSNP():该网站是由美国麻省理工学院建立的。它包括数千条已经定位的SNP，可以通过指定染色体的某一区域查询SNP。

其它的SNP站点还有：华盛顿大学，网址是：;美国人类基因组研究所，网址是：www.nhgri.nih.gov/About-nHGRI/Der/variat.htm。

SNP的优点及其应用由于SNP在任一特定位点上只有2个等位基因，因此，与简单序列长度多态性(SSLP)相比，其所涵盖的信息量很有限，似乎很难满足疾病易感基因精确定位的要求。但这个不足可通过加大分布密度来弥补，而且，这个目标并不是难以实现的，因为完整的SNP图谱完成之后，可以提供远高于此要求的密度。有研究认为，1个二核苷酸重复多态性标记的信息量大约是SNP的2.25～2.5倍，也就是说，1个有900～1000个均匀分布的SNP的图谱在进行基因组扫描时，其所能提供的信息量就足以和目前最常用的有400个标记位点的多态性图谱的信息量相当［6］。所用SNP数量虽多，但因检测速度快，故它将能最终取代SSLP，用于复杂性状的多基因遗传病研究。

人类的遗传连锁图谱至今已发展到了第三代。第一代是限制性酶切片段长度多态性(RFLP)图谱，第二代是微卫星标记图谱，第三代图谱就是SNP图谱。

SNP用作遗传标记具有以下优点：(1)SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。(2)它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。(3)与串联重复的微卫星位点相比，SNP是高度稳定的，尤其是处于编码区的SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。(4)部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。(5)易于进行自动化分析，缩短了研究时间。

由于SNP具有以上优点，所以其应用范围较微卫星标记更加宽广，它对群体遗传学、制药业、法医学、癌症及遗传性疾病甚至进化的研究都将产生不可估量的影响。

预计今后SNP将在下列领域发挥重要作用：(1)进行简单和复杂疾病的遗传连锁分析(linkageanalysis)及关联分析(associationanalysis),用于疾病易感基因定位；而且其定位的精度将比微卫星标记精细得多，可直接用于指导易感基因克隆。(2)在“药物基因组学”(pharmacogenomics)研究中，可通过检测SNP的遗传多态性标记揭示人群中不同个体对不同药物的敏感性差异的根本原因。(3)也可用于法医研究的罪犯身份的鉴别、亲子鉴定等，此外在器官移植中供体和受体间的配对选择及物种进化的研究中都将具有重要意义。

为了有效地利用连锁不平衡的效力，一个覆盖全基因组的数量至少为10万个SNP的图谱将是有效发挥其作用的前提。有人甚至认为，1个具有50万个SNP的图谱是不可缺少的［17］。但是，目前距此目标还相差甚远。

总之，SNP研究将是二十一世纪生命科学的热点。它与人类基因组计划一起，必将对人类的生产和生活产生不可估量的影响。

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医学遗传学系谱分析篇4

“炎黄计划”主要分三步：去年10月完成的“炎黄一号”黄种人基因组序列图谱是第一步。第二步是“炎黄99”计划。旨在进行99个人类个体基因组测序及多态性比较，构建黄种人的医学遗传多态性图谱。第三步是在此基础上开展的疾病研究等医学和健康相关的应用研究。

尴尬的测试结果：2005年，DNA研究的开拓者詹姆斯・沃森同意由美国454生命科学公司为自己绘制完整的基因组图谱。正式测序是在2007年3月。在此之前的两年时间，454生命科学公司提取了沃森血样，逐个识别沃森基因的30亿个碱基对。总共用了67天时间为这些碱基对排序。从而绘制了沃森的基因组图谱。

沃森曾公开表示。非洲人的智力低于白种人。观点一经公布。就遭到世人的质疑。而最为尴尬的还是后来沃森个人基因组所透露的信息。

冰岛的一家解码基因公司对开放于网站的沃森的个人基因组进行分析对比研究后发现，沃森的DNA图谱中含有黑人的基因，其基因组中的黑人基因数量是欧洲白人平均水平的16倍(多数欧洲后裔只携带不到1％的黑人基因)。据此，解码基因公司的研究人员说，沃森的曾祖父母或外曾祖父母中可能有非洲人。

尽管对沃森个人基因组的研究结果会有相当多的解读，但有一点不容置疑，即人类不论种族，其基因是相互渗透的；即使有差异，但从基因层面来说也是比较小的。

看基因的“脸色”生活美国塞莱拉遗传公司的创始人、现年60岁的文特尔的基因组则体现了个人健康与遗传关系的特点。他的父亲59岁时就死于心脏病突发。文特尔的基；因组显示。他患心脏病的概率大于一般人，因此最好选择高纤维、低脂肪的早餐食品。所以，在他的早餐食谱中只有一碗麦片和一杯加了少许红糖的脱脂牛奶，以减小罹患心脏病的风险。

当然，文特尔的基因也给予了他安心享受蔓味的权利，比如他在晚上可以放心享用牛排大餐，因为他所拥有的一个基因大大减少了他感染疯牛痛的风险。DNA分析还为他的蓝眼睛找到了决定性依据，那是一个名为0CA2的基因。不幸的是，文特尔的CFH基因发生了变异。这让他因老年性黄斑痛变而失明的风险增加了4倍。

医学遗传学系谱分析篇5

关键词：分子标记；药用植物；简单序列重复（SSR）；扩增片段长度多态性（AFLP）；单核苷酸多态性分析技术（SNPs）

中图分类号：S567文献标识码：A文章编号：0439-8114（2017）13-2401-05

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.13.001

ProgressandApplicationofMolecularMarkerTechnologyinMedicinalPlants

CHENHong-boa，YUJin-ruib，YANGChun-xianb，QIANGanga

（a.DepartmentofCellBiologyandGenetics；b.SchoolofDentistry，ZunyiMedicalCollege，Zunyi563003，Guizhou，China）

Abstract：Bysummarizingtheprincipleandtechnicalcharacteristicsofthecommonlyusedmolecularmarkertechnologyinrecentyearsanditsapplicationinthefieldofmedicinalplantresearch，thispaperprovidesareferenceforthedevelopmentandevaluationofmedicinalplantresources，andfurtherprovidesideasforthescreeningandverificationoffunctionalgeneofmedicinalplants.

Keywords：molecularmarker；medicinalplants；simplesequencerepeat（SSR）；amplifiedfragmentlengthpolymorphisms（AFLP）；singlenucleotidepolymorphisms（SNPs）

中是野生中药材资源最为丰富的国家，目前已识别有11000多种，无论其种类或数量均列世界之首[1]，为中国中药文化产业的国际化创造了丰富的资源条件。但近年来，随着人们对养生、保健等意识的不断提高，导致中药材的市场需求极度扩增，一些以野生种质消耗为主的名贵中药材正面临濒危甚至灭绝。传统的研究利用方法在药用植物识别、开发、利用以及保护等方面都相对落后。然而近些年，以RFLP[2]为代表的DNA分子标记技术的兴起，为实现当代药用植物研究的现代化提供了现实手段与条件。分子标记技术（亦或分子鉴别技术或DNA分子标记技术）[3，4]，是一种基于遗传物质的研究方式，这使其具备了不受生长环境的影响、检验精度高及重现性好等优点。随着DNA分子标记技术的不断运用与革新，以分子杂交为基础的第一代标记技术，由于操作过程复杂、周期长等原因，正逐渐退出分子研究领域。而围绕PCR技术为核心的新型分子标记技术正广为使用，并日臻成熟。

1常用分子标记技术的原理及特点

1.1简单序列重复（Simplesequencerepeat，SSR）

SSR亦称为微卫星DNA，它由2-5个碱基组成，如（GA）n、（TG）n、（GAC）n等，其中最常见为二核苷酸重复形式。SSR序列的长度在不同基因组间由于重复次数以及程度的不同具有高度的变异性，而展现出较高的多态性。SSR标记原理是根据其两端的保守序列设计特异性引物，经过PCR扩增后，再利用变性或者非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，继而体现不同样本基因组DNA的多态性。

简单重复序列具有较多优点，其共显性可区分纯合型与杂合型，以及还有灵敏度高、稳定性好以及操作简便等优点。但目前SSR获得的方式参差不齐，前提都是要提前知道目的基因的序列信息。

1.1.1简单重复区间序列（Inter-simplesequencerepeat，ISSR）ISSR是Zietkiewicz等[5]于1994年发展起来的一种加锚SSR技术。它的原理是在SSR引物的5′或3′端锚定2个或以上的SSR碱基，引起特定位点退火，从而提高扩增专一性，得到的特异性片段再通过变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离，最后根据不同的多态性条带分析多态性。

其优点在于无需提前知道样品基因序列，ISSR可为研究者快速高效地提供基因组信息；引物序列相对较长，通过提高退火温度进而保证了结果的可靠性；样本DNA质量要求不高，且所需量少；引物的通用性广，不具种属特异性。但在实际应用中也存在一定缺陷，如：稳定的实验体系条件需要探索构建，且显性标记亦不能区分纯合型和杂合型。

1.1.2表达序列标签（Expressedsequencetags，ESTs）表达序列标签是基于EST数据库或cDNA文库的一种标记技术，是一种能快速、高效地揭示基因容量的标记方法，由1989年Venter首次提出。它能特异地展示出基因某一位点的表达情况，能够直接反映出功能基因的生物信息[6]，同时也为地道药用植物的鉴别、开发利用提供了新的候选基因。因此，基于ESTs开发的SSR技术（即EST-SSR）是一种稳定、可靠的分子标记技术[7]，可直接用于基因作图[8]，从而指导功能基因的预测。

EST-SSR与传统SSR技术相比较，无需构建DNA文库而节约了实验成本。而且，在功能基因研究方面，EST-SSR更接近功能基因组；表达序列标签直接来源于编码序列，从而为基因组比较学以及同源基因的研究提供更可靠的途径。但也有不足之处：与SSR相比，多态性较低；同时，ESTs只代表了基因组DNA的一部分，所包含的信息不够全面，且现行的一些序列拼接软件也存在一定的局限性，分析过程中也可能丢失一些重要的基因组信息。

1.2扩增片段长度多态性（Amplifiedfragmentlengthpolymorphisms，AFLP）

AFLP是1992年荷兰科学家Zabeau和Vos发明的一项新专利[9]。其原理是植物基因组DNA经过限制性内切酶酶切后（通常采用双酶切），与特定的接头相结合而得到带有特定接头的特异性片段，这些片段再与PCR引物的3′端识别后进行特异性扩增，最后再将扩增产物通过聚丙烯酰氨凝z电泳筛选，进而分析其多态性。

AFLP是RFLP技术与PCR技术的结合，其具备了高多态性、操作简易、可以同时处理大量样品等优点。近年来，AFLP已广泛应用于药用植物遗传图谱的绘制、物种遗传多样性分析及分类研究、辅助育种、功能基因定位等多方向的研究[10，11]，且AFLP目前已被公认为构建DNA指纹图谱最可靠的分子标记。其缺点主要是对样品DNA的质量要求较高，实验成本也较昂贵，扩增所得结果的分析也相对困难。

1.3DNA条形码技术

2003年Guelph大学的Hebert等首次提出DNA条形码的概念。它是以足够变异且相对较短的DNA序列为标准，建立的一种新的生物身份鉴别系统，从而实现对物种快速、精准地识别和鉴定，其类似于超市使用条形码鉴别不同商品。通过特异DNA的比对，对于新种和隐种的发现也具有现实性的帮助[12]。Lahaye等[13]通过单独使用matK基因对1000多种兰科植物进行系统分析，结果证明单独使用matK基因能够发现兰科隐种并证明了DNA条形码分析的可行性；Newmaster等[14]运用DNA条形码技术发现了感应草属的3个隐种以及草沙蚕属的1个新种。在2008年召开的植物无国界会议上提出了“超级条形码”技术[15]，决定将叶绿体全基因组序列作为条形码序列应用在植物物种的鉴别上。Shinozaki等[16]第一次完成了单一物种叶绿体全基因组的测序；2008年Diekmann等[17]又提出了一套较为标准的叶绿体DNA提取方法。Parks等[18]通过对松属37个样本进行叶绿体全基因组测序分析，验证了叶绿体基因组可以作为植物物种水平上的条形码。近年来，DNA条形码技术在药用植物研究中的报道也逐渐增多，对于加快中国生物进化研究的步伐具有重要意义[19，20]。

1.4基因芯片技术

基因芯片又称DNA芯片或寡核苷酸阵列，它是将大量已知的探针固定在支持物上[21，22]，通过核酸杂交，再利用激光扫描及分析，来实现对目的基因表达水平或多态性的分析。其高通量、自动化的优势使其广泛用于基因的定位、药物的靶向分析及新药研发中。Schena于1995年第一次在论文中发表了DNAchip相关研究，Fodor又于第二年年底研制出了第一块DNA芯片[23]。

基因芯片技术目前主要应用于一些新药的研发[24，25]、药物靶向研究以及疾病的诊断等方面。Watanabe等[26]采用高密度基因芯片技术，对经Egb761处理的小鼠的皮层和海马细胞的基因表达进行了研究，分析得出其具有拮抗神经病变的药理作用。李美德[27]应用全基因组表达芯片来检测从黄芩根中分离出的汉黄芩素作用于肝癌细胞后的基因表达情况，结果发现406个差异明显的表达基因，通过差异基因的筛选和分析，从而确定了汉黄芩素抗肝癌的分子机制，对药物靶向基因的确定，以及抗癌药物的开发提供了新的依据。郭旭东[28]通过基因芯片技术对急性心肌梗死（AMI）患者和健康者外周血的RNA进行差异分析，发现其中的差异基因CYP4F3和USP25可能为AMI诊断的基因标记。张玉金等[29]通过利用从中国2010年版药典中筛选出的基原植物以及从NCBI数据库中下载的相应序列进行分析，得到13814条特异性探针，为中国药典中基原植物检测芯片的建立做出了重要贡献。近年来，不同领域的实用芯片陆续都有报道，且基因芯片技术目前已是高通量药物筛选的主要途径，同时也是中药活性成分筛选的重要手段。

1.5单核苷酸多态性分析技术（Singlenucleotidepolymorphisms，SNPs）

SNPs是等位基因之间的单个核苷酸差异，如单个核苷酸的缺失、插入或者是突变等[30]。SNPs标记技术相比微卫星技术而言，SNPs描述的是一种双等位基因的多态性，而SSR则是多位点等位基因之间的多态性，故SNPs在数量上远远超过SSR，因此具有更高的多态性。在人的基因组中，大概1000bp就会出现一个SNP，因此可以其作为DNA的一种特异性标记[31]。Xu等[32]通过对水稻亲本9311的SNP检测，得到了768万个多态位点，从而绘制了1张高密度的Bin图谱并成功定位了1个QTL。目前，由于SNP技术主要依靠于基因组DNA的大量测序或者是基因芯片技术，且技术要求高以及实验成本大等原因，导致在药用植物方面的研究也相对匮乏。

2DNA分子标记技术在药用植物中的研究应用

2.1中药材种质资源的鉴定、评价及道地性研究

种质资源是指亲本遗传给子代的遗传物质，其包括“道地性”种质资源、新种及重要培育品系等。徐蕾等[33]通过运用SSR标记技术在铁皮石斛种群遗传多样性的研究，证实了铁皮石斛具有较高的遗传多态性，并顺利将36份铁皮石斛材料分成了3个类别。Shen等[34]利用筛选出的ISSR引物准确地鉴别出了8个野生种石斛药品。李永清等[35]利用ISSR技术成功将36份铁皮石斛材料划分为6个类群。赵香妍等[36]通过ISSR标记技术在北京地区野生柴胡种质资源中的研究，得出北京地区野生柴胡具有一定的地域性分布特征，应加以保护及推广种植。

2.2中药材真伪的鉴别及品种鉴定

随着中药材市场需求的不断扩大，中药材市场鱼目混珠的情况时有发生，同类药材由于道地性等导致药效也相差甚远，而常规的检测方式却很难区别。但现行的DNA分子鉴别技术基于高稳定性、不受环境因素及个体发育影响等优点，可以保证鉴定结果的准确性。马晓冲等[37]通过研究证明基于SNP的分子标记技术能够稳定地鉴别中药材泽泻。滕艳芬等[38]利用matK基因已成功将正品与混淆产品鉴别开来。

2.3遗传多样性及种属亲缘关系的研究

药用植物遗传多样性及亲缘关系的研究，对于认识物种的进化历程、遗传育种及物种改良等均具有重要意义。传统的研究方法均是基于对表达产物的研究探索，但药用植物的化学成分及其含量、外部形态等均会由于生长环境及其他因素影响而有所差别。因此，从传统研究的角度探索药用植物的遗传多样性就存在很大的局限性，而从分子角度出发的分子标记技术能有效地揭示物N进化演变过程中遗传物质流动的真实本质，从而使得分子标记技术能够阐明物种进化、遗传背景以及种内或种间遗传关系，为中国珍贵及濒危中药材的开发、利用和资源保护提供真实依据。

近年来，随着分子标记技术的不断应用与发展，已有多种DNA标记技术成功运用于中药材遗传多样性研究及亲缘性分析中。YANG等[39]运用SSR分子标记技术对吉林省5个不同产地的人参材料进行分析，得出不同产地的人参在遗传物质上呈现出较高的多态性。Li等[40]于2013年利用SSR标记法对洋玉兰叶绿体全基因组进行近缘物种比对分析，结果显示洋玉兰叶绿体基因组的重复序列保守性相对较高。2014年，Galina等[41]又运用SSR标记技术对俄罗斯濒临灭绝的人参进行了种群遗传性状的分析。朱田田等[42]利用ISSR对甘肃不同产地中麻黄的遗传关系进行了分析，得出中麻黄遗传距离跟地理距离有一定的关系。黄颖桢等[43]通过使用ISS标记技术对金线莲遗传多样性进行分析，得出在野生种质资源间金线莲具有丰富的遗传多样性。叶炜等[44]通过利用ISSR对金线兰及其近缘物种的遗传多样性进行研究，得出种群间可能存在基因的交流。唐晓清等[45]利用AFLP技术对不同农家栽培类型的丹参进行分析，结果表明AFLP技术可以作为识别丹参不同栽培类型间遗传差异的手段。李勇等[46]利用AFLP技术通过对金莲花遗传多样性的研究，得出地理位置较近的种质遗传相似度较高。唐美琼等[47]利用AFLP技术对广西草珊瑚遗传性状进行研究分析，结果显示广西草珊瑚遗传多样性偏低，须尽快采取相应措施。沈亮等[48]通过AFLP技术分析梭梭遗传多态性得知该物种种内丰度较高，各地区之间的分化较小。李永清等[49]通过ISSR在37份药用石斛亲缘关系研究中的应用，得出ISSR分子标记技术完全可以应用于石斛物种亲缘关系的分析。朱田田等[50]通过对不同黄芪和党参栽培品种遗传关系的ISSR分析，得出不同品种的黄芪和党参拥有较高的遗传多样性，而且种间差异较大。蒋雨晗等[51]利用ISSR分子技术对14份不同来源的白芍进行研究分析，证明了4个栽培种跟野生种之间有一定的遗传差异性，而且可以从基因水平把外型相似的白芍栽培品种区别开来。

2.4DNA遗传图谱的构建及数量控制基因定位

DNA遗传图谱也称基因遗传图谱或连锁图谱，系指基因在染色体上相对应的位置。自从第一张遗传图谱的构建以来，越来越多关于药用植物DNA图谱的构建也相继报道。周志勇等[52]首次用AFLP技术构建了人参和西洋参的DNA指纹图谱，这对人参的鉴别提供了非常有效的工具。虞泓等[53]利用AFLP对石斛4个内种和1个外群种进行DNA多态性分析，用筛选得到的引物构建了5个种的DNA图谱，并应用bootstrap进行了检验，该研究证明了AFLP标记技术可用于构建石斛基因组指纹图谱。赵红燕[54]则利用EST-SSR、ISSR、RAPD、SRAP等4种分子标记技术成功构建了浙江铁皮石斛563个遗传连锁。郑伟耀等[55]运用SSR标记天麻基因组DNA，分析得出扩增位点与天麻素含量有关。巫桂芬等[56]通过黄麻基因DNA分子指纹图谱的构建，得出每一种被识别出的物种均有其特有的分子“身份证”。

3展望

中国药用植物种质资源非常丰富，但是近年来由于气候的变化以及过度的开采，使得一些稀少的野生药材资源更是急剧减少，市场也相对混乱，因此从生物本质出发的DNA分子标记技术对于中国药用植物的鉴定、保护、开采、利用及改造就显得格外重要。目前，分子标记技术在药用植物中的研究主要体现在遗传多样性研究、种质鉴别及评价、DNA指纹图谱构建以及基因定位几个方面。

目前在药用植物研究应用中的DNA分子标记技术尚存在以下几个问题：DNA标记技术在中药材研究中的应用较少，而且存在方向聚集现象，近年关于药用植物亲缘性的研究越来越多，然而在其他一些领域，如药材活性成分分离与提取以及相关成分控制基因定位等方面的研究却少有报道，研究范围不够全面和深入。另外，每一种分子标记技术都有其各自的优缺点，实验结果具有一定片面性，而标记技术的联合应用也处于相对空白状态；技术要求高，技术培训相对缺乏。因此，需要加大分子标记技术的研究应用，以便增加其在药用植物研究中的实用性和可靠性，通过以不同分子技术的研究为基础，可达到明确中药材有效药用成分的基因构成，以及各种药用植物基因的调控原理及产物的靶向作用原理，以便对中国中药品种的保护利用及产业化做出更大的贡献，以此实现中国中药文化的规范化、产业化以及国际化。

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医学遗传学系谱分析篇6

关键词半夏;植株形态变异;遗传多样性;有效成分;驯化栽培

半夏(pinelliaternata(thunb.)breit.)又名麻芋头、麻芋子、天落星和野芋头等,为天南星科半夏属多年生草本植物,广泛分布于我国长江流域以及东北、华北等地区[1]。半夏是我国重要的传统中药材,也是重要的出口产品。随着半夏利用范围的不断扩展和市场价格的攀升,有关研究也较为活跃,同时也存在很多亟需解决的问题。

1半夏植株形态变异研究

具有丰富的形态变异是半夏属植物的一个重要特点。生长于不同环境或同一生态环境的不同居群甚至同一居群的不同个体间,各种器官(包括根、球茎、珠芽、叶片、叶柄等)在形态上都存在着丰富的变异类型。其中以叶、球茎和珠芽的变异更明显。对叶和球茎的变异,较早的文献中已有较多报道。近年来,半夏珠芽变异引起研究者的重视。

半夏珠芽变异主要表现在珠芽数量、珠芽着生位置和芽眼数量等方面。据赵忠堂等[2]研究,不同类型半夏形成的珠芽数量差异较大,以线形叶型半夏的珠芽数量最多,芍药叶型半夏的珠芽数量最少。半夏珠芽的多少与种茎大小呈正相关,即同一类型的半夏,种茎越大,形成的珠芽数越多,珠芽在产量中所占比例也越大。还有一类无论是叶柄还是叶端均不结珠芽的“新居群”,经移栽试验和原分布地考证,该类半夏遗传性状稳定。

半夏珠芽正常着生位置在叶柄下部内侧,但有的半夏在叶端也可着生1枚珠芽。据彭延弟等[3]观察,叶端着生珠芽的多为野生的芍药型半夏;在椭圆至披针型和竹叶型半夏偶尔也有,但这类半夏遗传性状不稳定。正常情况下,1枚半夏珠芽上只有1个芽眼,但有时也可见到双芽眼或多芽眼,是由于在珠芽一侧出现疣状突起所致。

对半夏珠芽形态变异的研究不仅有助于揭示半夏种内各类型间的演化关系,也有助于弄清半夏属各种间的系统关系。郭巧生等[4]曾将珠芽变异与其他性状相结合,对主要引自长江中下游地区的15个半夏居群的16个主要形态性状进行模糊聚类分析,将15个居群分成4个类型,即叶柄上均具双珠芽但叶型和块茎形态变异较小的双珠芽型、叶柄上只着生单珠芽但叶型和块茎形状变异较大的普通型、叶柄上具单珠芽但着生位置较低且块茎呈钜圆形的长茎型和叶柄上具单珠芽但居群内常有双珠芽个体出现的复合型。这对于半夏的生物学特性及遗传种质差异等研究具有借鉴意义。

2半夏遗传多样性研究

半夏是一个广布种,具很大生态幅,遗传差异十分明显。据shoyama等报道,半夏种内各群居普遍存在着染色体的复合多倍现象,不同群居的染色体数目为2n=28、72、96、104、108、115、116、118、128。染色体数目的丰富变异决定了半夏的遗传多样性。开展半夏遗传多样性研究,对于半夏资源的保护和合理开发利用具有十分重要的意义[5],但其研究的难点在于找到有效的分析方法。

近年来,借助同工酶技术进行半夏遗传多样性分析的工作日渐增多。张袖丽等通过分析安徽产半夏属的滴水珠、鹤落坪半夏、虎掌及半夏3个居群共6个分类群植株的叶和球茎的est、mdh、adh、sod同工酶,认为叶和球茎中est、mdh的谱带在几者之间都有相互区别的特征,可以作为鉴定原植物及其产地的生化指标。郭巧生等[6]对栽培在同一生境下的16个半夏居群同一生长期叶片中酯酶(est)和超氧化物歧化酶(sod)同工酶谱进行了比较分析,认为est和sod同工酶谱在各居群间甚至同一居群内,除少数共有的特征谱带外都存在着较明显的差异。choi等利用电泳技术研究了半夏愈伤组织中可溶性蛋白质和est同工酶谱型,结果表明由于外植体(花茎、叶脉间和次微管区组织)的不同,电泳谱型存在着十分明显的差异,同时发现谷草转氨酶(got)和过氧化物酶(per或pod)2种同工酶的谱型随培养时间的变化而变化。共有的特征性谱带可认为是相互之间具有共同起源的基因表现,而不同的谱带说明各自在特定的生长环境或不同的进化过程中已发生了趋异分化。

但以同工酶技术分析也存在较大的局限性。即使在半夏的同一居群内,不同个体间也存在着差异;进行同工酶分析时只能以某一类型或某一居群的部分个体为对象,采用计算相互之间的遗传一致度或相同值,甚至直接比较酶谱,显然都缺乏代表性。因此,有研究者认为,采用计算酶谱频率的方法从群体水平比较居群之间的异同,其结果可能要可靠得多。同时,对于多性状的比较分析如采用传统处理办法常会遇到性状的取舍问题,也会影响分析结果,而运用模糊聚类分析的办法更有利于对种内复合体的分类作出客观评价。

郭巧生等[7]还通过对不同半夏居群化学成分的比较来为半夏遗传多样性研究提供依据。结果表明,栽培在同一生境下的6个半夏居群间β-谷甾醇、缬氨酸及精氨酸含量存在很大差异;他们还采用田间试验的方法对16个半夏居群生长节律进行了连续2年的平行比较观测,认为半夏各居群在出苗、展叶、抽薹及倒苗期等方面存在差异。认为这种生长节律方面的差异也可以作为判断不同居群遗传差异的参考依据[8]。

此外,从遗传多样性研究所用的材料看,有观测认为,半夏种内各居群的性状分化除营养器官有很大变异外,生殖器官的变异也较大,实际上后者比前者更具有分类价值。

3半夏有效成分研究

半夏有效成分比较复杂,主要为生物碱、天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、氨基丁酸、半夏蛋白、β-谷甾醇、葡萄糖苷及尿黑酸等。有效成分含量的高低将直接反应半夏作为中药材的品质优劣。季文兰等[9]对狭叶半夏和竹叶型半夏的氨基酸含量测定表明,狭叶半夏的总氨基酸含量高于竹叶型半夏,而且具有一定镇咳祛痰活性的天门冬氨酸的含量也是狭叶半夏高于竹叶型半夏,这可作为狭叶半夏的品质优于竹叶型半夏的重要依据。魏淑红等[10]采用重量法和酸性染料比色法测定表明,狭叶半夏的总生物碱含量高于普通半夏,这也从一个方面反应了狭叶半夏品质优于普通半夏。白权等对川产半夏的总生物碱、β-谷甾醇和鸟苷3种化学成分的含量进行了分析比较,结果表明栽培半夏和野生半夏总生物碱含量差异较大,即使是同一地区所产半夏,总生物碱含量也有高低之分;栽培半夏与野生半夏β-谷甾醇含量分布较为一致,但不同产地半夏β-谷甾醇含量有差异;栽培半夏鸟苷含量高于野生半夏。于超等研究认为,野生半夏的生物碱含量普遍高于栽培品种。曾建红等还研究半夏不同采收期总生物碱含量的动态变化,认为不同采收期半夏的总生物碱含量差异显著。

半夏蛋白是一种植物凝集素,具有抗肿瘤、抗生育等重要的生理作用,tao等将半夏蛋白结晶后,经x射线衍射得出该蛋白的立体构象,发现这种蛋白富含β-sheet及少量的α-helix结构。shen和王克夷等从三叶半夏分离出的结晶半夏蛋白具有凝集和致有丝分裂的活性,同时也是一种毒素,具种系和细胞类型特异性,能够将细胞穿孔,形成离子通道。kurata等通过凝胶电泳和层析,从天然半夏球茎球蛋白组分离出了一种名为6kdp的糖蛋白,通过定量分析技术(eia)测得其总含量为5.75%~8.30%,是半夏球茎中主要的蛋白质之一,并且认为该糖蛋白含量的高低可作为半夏球茎定量分析的一个标准。

此外,张科卫等还研究半夏药材中的脂肪酸成分,发现半夏药材中含有较多不饱和脂肪酸。但由于半夏有效成分十分复杂,除上述主要成分外,对其他有效成分的研究还有待于进一步深入。

4半夏驯化栽培进展

随着半夏野生资源日趋枯竭,半夏的人工驯化栽培成为必然。但人工栽培的问题是种源缺乏,繁殖系数低,同时易感染病毒病,药材质量不稳定。近年来,利用植物器官(茎、芽、根、胚和毛状根等)培育和生产植物产品技术得到迅速发展,特别是组织培养一步成苗法为半夏无性系快速繁殖体系的建立提供了技术支撑。一步成苗法再生周期短,繁殖系数和再生频率高,并能保持半夏原种特性,可作为半夏快速繁殖的有效途径,直接应用于生产。目前,选用半夏球茎、珠芽、叶片、叶柄等作外植体,都成功实现了组织培养的一步成苗。袁燕东等认为,半夏组培试管苗的生长发育和产量均明显优于珠芽与种子,它可以越过半夏的“幼年期”而直接到达“成年期”,并且它比“成年期”的珠芽还具有优良特性。因此,在半夏紧缺时,采用生物工程技术快速繁育组培试管苗,在生产上有重要意义。

半夏的人工驯化栽培也受到重视。山东、安徽、四川等在半夏的人工栽培方面都有较成熟的经验,有的已形成了较完善的成套栽培技术。如在播种和田间管理,包括除草、控水、追肥、培土、遮荫和摘蕾等方面都有较为规范的技术规程;在主要病虫害识别和防治、倒苗预防和球茎防烂等方面都已取得一些经验。张明等还将栽培半夏和其栽培所用的土壤用原子荧光光谱法进行测定,分析了栽培半夏中的重金属含量与土壤重金属含量的关系,对防止人工栽培半夏的品质劣化有积极意义。何道文等[11]还对种茎质量与半夏生长特性和块茎收获量关系进行了研究。

5半夏炮制技术及真伪辨别研究

半夏作为中药材应用,必须根据不同用途采用不同的炮制方法。半夏炮制的最主要目的是祛毒存性、减毒增效。衡量半夏炮制品质量优劣的依据是药理功效的强弱和毒性、刺激性的大小。常用的半夏炮制品有熟半夏、清半夏、姜半夏和法半夏等。王潮奎等[12]研究了半夏炮制过程中加矾量、加热方式与所炮制饮片质量和毒性的关系,结果表明半夏加热加压30min和经8%白矾溶液浸制均可使半夏的麻辣味消除,且水浸出物量增加。高昌琨等通过小鼠扭体试验和家兔眼结膜致炎反应试验,认为不同半夏炮制品对动物黏膜的刺激性大小为生半夏>清半夏>姜半夏>法半夏。赵典刚等认为半夏解毒的方法多种多样,其中以熟半夏的炮制方法简捷、工艺流程数据化、生产成本低,能较好地适应中药现代化发展要求;同时不需要白矾等传统辅料,能有效地防止al3+对炮制品的污染。邓然兴等认为,采用蒸制法姜半夏,可以克服传统炮制工艺中存在的系列缺点。杨玉琴等还用原子吸收法测定半夏炮制品中的微量元素,结果显示:生半夏、姜半夏、法半夏、清半夏含有较多的微量元素,生半夏炮制后,镁元素的含量剧增。因此,如何将传统的中医临床用药理论和现代科学方法相结合,不断进行工艺革新和制定炮制规范是半夏开发利用中的一项重要任务。

药用半夏正品是天南星科半夏属植物。但由于半夏资源短缺,在医药市场上以其他植物充当半夏的情况时有发生。据报道,全国至少有3属12种植物作为半夏代用品使用,充当半夏的植物主要有水半夏、白附子、山珠半夏、狗爪半夏等;在黑龙江发现以紫茉莉根茎处理后充当半夏片,其形态特征与正品极其相似;还有以幼天南星经过蒸煮伪充半夏食用的情况。因此,人们对半夏的真伪的鉴别也进行一些相关研究。

伪品与正品半夏尽管有一定相似之处,但通过性状鉴别、显微特征、层析法鉴别包括薄层色谱法和纸层色谱法等办法均可区别。如半夏与水半夏除在外观形态上有明显区别,可通过性状鉴别、显微特征鉴别以外,也可以通过层析法等方法鉴别。吴皓等通过试验发现,半夏药材的鉴别成分次黄嘌呤核苷为一核苷类成分,该成分水溶性强,对热稳定,且仅在半夏药材中含有。刘玉萍等采用pcr直接测序技术测定半夏及其伪品的18srrna基因序列并作dna序列变异分析认为,在采用传统生药学手段难以鉴别半夏正品与混淆品的情况下,通过dna测序这一高效准确的dna分析方法可在分子水平上解决半夏真伪鉴别问题。将dna分子技术引进中药质量标准研究是今后中药分析的一个发展新方向。

6参考文献

[1]中国医学科学院药物研究所.中药志(第2册第2版)[m].北京:人民卫生出版社,1993.

[2]赵忠堂,吴在军,张来启,等.半夏球茎与珠芽的生长状况研究[j].基层中药杂志,2001,15(3):22.

[3]彭延弟,李光胜.半夏植物形态变异的观察与研究[j].基层中药杂志,2001,15(5):30.

[4]郭巧生,贺善安.半夏种内居群形态变异的模糊聚类分析[j].植物资源与环境,1997,6(3):29-34.

[5]陈家宽,杨继.植物进化生物学[m].武汉:武汉大学出版社,1994.

[6]郭巧生,沈文飚,刘丽,等.半夏种内不同居群酯酶和超氧化物歧化酶同工酶酶谱特征分析[j].植物资源与环境学报,2001,10(2):42-46.

[7]郭巧生,段金廒,贺善安.半夏不同居群3种化学成分的动态比较研究[j].中国中药杂志,2001,26(5):296-299.

[8]郭巧生,贺善安,刘丽.半夏种内不同居群生长节律的研究[j].中国中药杂志,2001,26(40):233-236.

[9]季文兰,杨权海.不同种质半夏氨基酸含量测定[j].时珍国医国药研究,1997,8(6):554.

[10]魏淑红,彭正松.狭叶半夏和普通半夏总生物碱含量比较[j].现代中药研究与实践,2003,17(2):19-20.