细胞生物学特性篇1

关键词：体液免疫;抗原;吞噬细胞;B细胞;T细胞

在人教版普通高中生物教材必修3《稳态与环境》的教学过程中，学生往往对体液免疫示意图产生这样的疑问：是否某一种类的抗原可以通过吞噬细胞和T细胞的呈递来活化B细胞，同时也可以运用直接刺激B细胞的方式来进行活化？针对这样的疑问，通过抗原的分类来进行简要分析。

1问题的产生

关于同一种的抗原是否既可以通过吞噬细胞和T细胞的呈递来活化B细胞，同时也可以运用直接刺激B细胞的方式来进行活化，这一疑问的产生主要是由于人教版普通高中生物必修3《稳态与环境》教材中37页图2-15“体液免疫示意图”引出的。如图：

图一体液免疫示意图

2问题的解析

由于示意图带来的困惑与知识混乱，如何让学生能够清晰区分体液免疫中B细胞被活化的具体过程，关键要让学生对于抗原及其分类有个直观的认识。

2.1抗原的特性

人教版高中教材上对于抗原的定义为：能够引起机体产生特异性免疫反应的物质。并举例病毒、细菌灯病原体表面的蛋白质等物质，都可以作为引起免疫反应的抗原。同时根据现代抗原的概念，抗原必须具备二种特性，即免疫原性和抗原性。

抗原的免疫原性（immunogenicity）是指抗原分子能诱导免疫应答的特性。它涉及到了抗原分子与免疫细胞间的相互作用，也就是说它必须经过抗原呈递细胞的加工、处理和呈递作用，以及可以被T细胞和B细胞的抗原识别受体所识别。因此抗原的免疫原性与抗原分子的化学性质相关，更与机体的免疫应答特性相关。

另一方面，抗原的抗原性（antigenicity）是指抗原分子能与免疫应答产物，即抗体或效应T细胞发生特异反应的特性，故亦称之为抗原的反应（reactivity）。它只涉及抗原分子与抗体分子或T细胞的抗原受体分子（TCR）间的相互作用，即分子与分子间的相互作用。只是抗原分子表面的有限部位能与抗体分子结合，称此部位为抗原决定簇（antigendeterminant）或表位（epitope）。因此抗原的抗原性主要决定于抗原分子的化学性质。如抗原为蛋白质分子，其抗原性可决定于其氨基酸序列或其空间构型。

2.2抗原的分类

由于抗原具有以上的特性，通常可以将抗原分为天然抗原、人工抗原、胸腺依赖抗原与胸腺非依赖抗原和超抗原四种类型。其中胸腺依赖抗原与胸腺非依赖抗原就是解决我们上述教学过程中遇到问题的关键。

实验证明，由抗原激发的免疫应答是多细胞相互作用的结果，也就是由抗原呈递细胞、T细胞和B细胞共同参与予完成的。

大多数抗原激发的体液免疫应答，必须有辅T细胞（helperTcell），简称TH细胞的参予才能完成，称这种抗原为胸腺依赖抗原（thymus-dependentantigen，TDAg），该抗原由T表位和B表位组成，可以刺激机体产生体液免疫和细胞免疫。

但是也有少数抗原物质，不需要TH细胞的参与，就可以单独刺激B细胞来产生抗体，称这种抗原为胸腺非依赖抗原（thymusindependentantigen，TIAg），该抗原由B细胞丝裂原及多个重复的B表位组成，可使不成熟及成熟的B细胞应答，只产生体液免疫应答不产生细胞免疫应答。

这二种抗原的区别主要在于其抗原决定簇的结构不同所致。TD抗原在其分子结构上，既具有载体功能的决定簇，也具有抗原性决定簇。且在其分子表面出现多种不同抗原决定簇，但缺乏重复出现的同一决定簇，TD抗原主要是大分子蛋白质。而TI抗原多数为大分子多聚体，带有重复出现的同一抗原决定簇，且降解缓慢，故不需要TH参加即能直接刺激B细胞，TI抗原主要是多糖类物质。

3问题的结论

由以上关于抗原的特性及分类特点可知，于人教版普通高中生物必修3《稳态与环境》教材中37页图2-15“体液免疫示意图”所示的体液免疫中同一种的抗原是否既可以通过吞噬细胞和T细胞的呈递来活化B细胞，同时也可以运用直接刺激B细胞的方式来进行活化这一问题的答案是否定的，少数抗原可被B淋巴细胞直接识别，其他的抗原需要抗原提呈细胞处理后才可以。

4教学建议

在高中生物的课堂上，可以简单跟学生介绍一下抗原的分类，分为胸腺依赖抗原与胸腺非依赖抗原。而两种抗原的特点就是前者对于B细胞的刺激需要T细胞的参与而后者不需要。那么根据这样的特点就很容易理解每一个抗原要么需要T细胞要么不需要T细胞的传递过程，因此不可能同一种抗原有两条不同的刺激B细胞的路径。

参考文献：

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[2]金伯泉.医学免疫学[M].北京：人民卫生出版社，2008.

[3]马兴铭、丁剑冰[M].北京：医学免疫学.清华大学出版社，2013.

[4]利迪亚德.免疫学[M].北京：科学出版社，2010.

细胞生物学特性篇2

目的:探索甘露聚糖结合凝集素（mbl）基因gga57gaa点突变引起免疫缺损的机制。方法:采用pcr从质粒pmblm57中扩增含gga57gaa点突变的mbl基因,构建重组真核表达载体,电转染cho细胞,以zeocin筛选并克隆化培养,用mab-sepharose4b和ni2+-ntaagarose层析纯化目的蛋白,以sds-page、westernblot、elisa、配体结合试验、c4d沉积试验等鉴定目的蛋白。结果:重组真核表达载体pcdna4/hismaxc-mblm57转染cho细胞后获得5株稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株;37glu突变型mbl蛋白主要以双链（mr约60000）存在,不能形成高聚体;其配体结合能力低下,与masp-2n端蛋白的结合能力也降低,不能通过凝集素途径激活补体系统。结论:gga57gaa点突变产生结构有缺陷的mbl蛋白,进而影响其识别功能和效应功能。

【关键词】甘露聚糖结合凝集素gga57gaa突变体37glu突变型蛋白识别功能效应功能

甘露聚糖结合凝集素（mannan-bindinglectin,mbl）是肝细胞分泌的血浆蛋白,为c型凝集素超家族中胶凝素家族成员［1］。mbl的糖识别域（carbohydrate-recognitiondomain,crd）是其识别功能区,可选择性识别多种病原体表面以man、mannac、glcnac等为末端糖基的糖结构;胶原样区（collagen-likeregion,clr）为其效应功能区,通过与mbl相关丝氨酸蛋白酶（mblassociatedserineprotease,masp）相互作用,激活补体凝集素途径,发挥溶菌和调理功能,还能与吞噬细胞胶凝素受体结合而发挥直接调理作用［1,2］。已发现3个可引起调理吞噬缺损的mbl结构基因点突变,分别位于外显子1的第54、57和52位密码:ggc54gac和gga57gaa,其编码产物gly为asp或glu取代;cgt52tgt的编码产物arg变为cys。这些点突变为常染色体显性遗传,其基因频率ggc54gac在欧亚人群中较高（≥0.11）,gga57gaa在次撒哈拉非洲人群中很高（达0.29）,而cgt52tgt在所研究过的人群中较低（≤0.06）［3,4］。我们对中国十余个民族的群体研究发现,其mbl基因点突变的频率多在0.1以上。显然,mbl缺损是迄今所发现的最常见的免疫缺损病。因此,阐明mbl基因突变引起免疫缺损的机制具有极其重要的意义。本课题组将人3种突变型mbl基因在cos7细胞中瞬时表达,证明mbl这些点突变不影响mbl蛋白的合成与分泌［5］;将cgt52tgt、ggc54gac突变体基因在cho细胞中稳定表达,发现32cys和34asp突变型mbl蛋白的寡聚化程度大大低于重组野生型和天然mbl蛋白［6,7］。那么,gga57gaa突变的影响是否同52、54位密码突变一样？本研究中,我们将gga57gaa突变体基因在cho细胞中稳定表达,并对37glu突变mbl蛋白进行初步的结构和生物学活性研究。

1材料和方法

1.1材料含人gga57gaambl突变体全长编码区基因的质粒pmblm57［8］、重组野生型mbl蛋白［9］、人血浆天然mbl蛋白［10］、重组人masp2-n端蛋白以及抗人mblcrd单克隆抗体（monoclonalantibody,mab）、mbl缺陷型人血清（基因型为lypb/lypb）、质粒pcdna4/hismaxc和大肠杆菌top10f`为南方医科大学免疫学教研室构建、制备和保存。限制性内切酶、taqdna聚合酶、t4dna连接酶、dnamarker和逆转录试剂盒购自takara公司。高相对分子量（mr）和低mr蛋白marker购自晶美公司。hrp-羊抗鼠igg抗体购自鼎国公司。质粒小量快速抽提试剂盒和dna小量快速纯化试剂盒购自申能生物公司。rpmi1640培养基、新生牛血清和zeocin购自invitrogen公司。ni2+-ntaagarose购自qiagen公司。抗人c4d单克隆抗体(mab)购自quedel公司。抗人mblmab［hyp131-11］购自abcam公司。cnbr活化的sepharose4b购自amershambiotech公司。抗hismab购自tiangene公司。centriconplus-20超滤膜（mrcut-off10000）购自millipore公司。甘露聚糖购自sigma公司。

1.2方法

1.2.1真核表达载体的构建与鉴定上游引物5′-cgggatccatgtccctgtttccatca-3′,含bamhⅰ酶切位点;下游引物5′-cggaattcactcacagacccttcagatagggaact-3′,含ecori酶切位点。引物由上海博亚公司合成。以pmblm57质粒为模板,以上述引物进行pcr扩增带有gga57gaa点突变的mblcdna片段,回收、纯化pcr产物。将cdna片段与pcdna4/hismaxc质粒分别经bamhi和ecori双酶切后,以t4dna连接酶于16℃连接8h,将目的基因片段插入pcdna4/hismaxc质粒中,转化大肠杆菌top10f′,以25mg/lzeocin筛选阳性克隆。小量提取质粒,用bamhi和ecori双酶切鉴定,经双向测序（由上海博亚公司进行）确证后,大量扩增。鉴定正确的重组质粒命名为pcdna4/hismaxc-mblm57。

1.2.2cho细胞的转染、筛选及克隆化于0℃在950μf、250v电击下,将重组表达载体pcdna4/hismaxc-mblm57转染cho细胞。具体操作参照bio-rad公司电穿孔仪操作手册。将转染后的cho细胞置12孔板内培养24h后,以800mg/lzeocin加压筛选。1周后,挑取单克隆细胞以相同浓度zeocin继续加压筛选20d。随后的1个月中,每隔3~5d换液1次,维持zeocin的浓度为200mg/l。稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株命名为cho-mblm57。

1.2.3外源基因表达的rt-pcr分析以1mltrizol试剂提取1×107个cho-mblm57细胞总rna后,采用逆转录试剂盒获取cdna产物。以cdna产物为模板,上述1对特异性引物进行pcr,用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。

1.2.4mbl-crdmab亲和层析柱的制备参照文献［11］方法,将mbl-crdmab与活化sepharose4b偶联,制备mbl-crdmab-sepharose4b层析柱。

1.2.5重组蛋白的纯化(1)收集cho-mblm57细胞培养上清,缓慢加入饱和(nh4)2so4溶液至终浓度为60%,于4℃搅拌2h沉淀蛋白,以8000r/min于4℃离心30min。将沉淀溶于0.01mol/lpbs(ph7.4,含0.5mol/lnacl)中,装透析袋,在pbs中于4℃透析24h,每4~6h换液1次。(2)以0.45μm微孔滤膜过滤,以1ml/min速度上样mbl-crdmab-sepharose4b柱,重复3次后于4℃反应2h。以10倍柱床体积pbs淋洗,至a280<0.05;用5倍柱床体积0.1mol/lgly-hcl（ph2.4）洗脱,流速为1.5ml/min,收集洗脱液,立即以1mol/ltris-hcl(ph9.0)中和ph值至7.0~7.2。(3)将初步纯化蛋白用平衡盐溶液（ph8.0）于4℃透析12h,每4~6h换液1次。上样ni2+-ntaagarose进行层析,具体操作见ni2+-ntaagarose层析柱说明书。目的蛋白于50mmol/lpbs（ph7.2）中充分透析去除咪唑及盐类,经超滤浓缩后即为37glu突变型mbl蛋白。

1.2.6sds-page和westernblot检测将37glu突变型和重组野生型mbl蛋白上样进行sds-page,部分胶进行常规染色;另一部分用于westernblot检测:电转移后,将硝酸纤维素膜膜置于30g/l脱脂奶粉中于4℃封闭过夜;加1∶3000稀释抗hismab于室温反应1h,洗膜5次;加1∶4000稀释hrp-羊抗鼠igg,室温反应1h,洗涤后以dab/nicl2底物液显色。

1.2.7酶联免疫吸附试验（elisa）将37glu突变mbl蛋白从20mg/l倍比稀释至0.6mg/l,加入酶联板中,100μl/孔,以天然mbl蛋白和重组野生型mbl蛋白为阳性对照,稀释液为阴性对照,4℃包被过夜;加入50g/l脱脂奶粉,37℃封闭2h;洗涤后,分别加入1∶5000抗人mblmab［hyp131-11］、1∶1000抗人mbl-crdmab或1∶5000抗hismab,37℃反应1h;洗涤后加入1∶5000hrp-羊抗鼠igg,37℃反应30min;洗涤后,加tmb底物液显色,以2mol/lh2so4终止反应,在酶联仪上测a450值。

1.2.8配体结合试验将10mg/l甘露聚糖加入酶联板中,100μl/孔,4℃包被过夜;加入50g/l脱脂奶粉,37℃封闭2h;tbs-t（含10mmol/lca2+）洗涤后,分别加入不同浓度（0.6~10mg/l）的天然mbl、重组野生型mbl和37glu突变mbl蛋白,100μl/孔,37℃反应1h;洗涤后,加入1∶5000抗人mblmab,37℃反应1h;洗涤后,加入1∶5000hrp-羊抗鼠igg,37℃反应30min;洗涤后,加tmb底物液显色,以2mol/lh2so4终止反应,在酶联仪上测a450值。

1.2.9重组蛋白与masp2-n端蛋白结合试验将10mg/l纯化重组人masp2-n端蛋白加入酶联板,100μl/孔,4℃包被过夜;加入50g/l脱脂奶粉,37℃封闭2h;tbs-t(含10mmol/lca2+)洗涤后,加入不同浓度（0.03~1mg/l）人血浆来源天然mbl、重组人野生型mbl和37glu突变型mbl蛋白,37℃反应1h,对照组稀释液中含10mmol/ledta;洗涤后,加入1∶1000鼠抗人mbl-crdmab,37℃反应1h;洗涤后,加入1∶5000hrp-羊抗鼠igg,37℃反应30min;洗涤后,加tmb底物液显色,以2mol/lh2so4终止反应,在自动酶联仪上测定a450值。

1.2.10c4d沉积试验将100mg/l甘露聚糖加入酶联板,100μl/孔,4℃包被过夜;加50g/l脱脂奶粉,37℃封闭2h;tbs-t（含10mmol/lca2+）洗涤后,加不同浓度（0.6~10mg/l）重组野生型和37glu突变型mbl蛋白,37℃反应1h;洗涤后,加1∶50稀释mbl缺陷型人血清,37℃反应1h;洗涤后,加1∶5000鼠抗人c4dmab,37℃反应1h;洗涤后,加1∶5000hrp-羊抗鼠igg,37℃反应30min;洗涤后,加tmb底物液显色,以2mol/lh2so4终止反应,在酶联仪上测a450值。

2结果

2.1真核表达载体的构建采用pcr获得长约750bp的cdna片段,将其定向插入真核表达载体中,构建重组真核表达载体pcdna4/hismaxc-mblm54。经bamhⅰ和ecorⅰ双酶切,可见2条带,其中约750bp带为目的片段。以特异性引物进行pcr,亦获得长约750bp的片段（图1）。通过dna测序,确认插入dna片段的序列与预期结果完全一致,带有gga57gaa点突变。

图1重组质粒的鉴定（略）

1:λecot14ⅰdnamarker;2:重组质粒pcdna4/hismaxc-mblm57的ecori酶切产物;3:质粒pcdna4/hismaxc的ecori酶切产物;4:重组质粒pcdna4/hismaxc-mblm57的ecori和bamhi双酶切产物;5:重组质粒pcdna4/hismaxc-mblm57的pcr产物.

2.2cho-mblm57细胞的筛选与克隆化培养采用电穿孔法,将重组表达载体pcdna4/hismaxc-mblm57转染cho细胞,经长达近2个月的zeocin加压筛选和维持培养,获得5株稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株,分别命名为b4-cho-mblm57、c7-cho-mblm57、f6-cho-mblm57、g5-cho-mblm57和g9-cho-mblm57。

2.3cho-mblm57细胞内目的基因mrna的表达提取1×107个cho-mblm57细胞的总rna,经rt-pcr扩增,得到长约750bp的片段,与预期结果一致（图2）。

图2rt-pcr鉴定目的基因mrna（略）

1:dl2000dnamarker;2:质粒pcdna4/hismaxc转染cho细胞的rt-pcr产物;3:重组质粒pcdna4/hismaxc-mblm57转染cho细胞的rt-pcr产物.

2.437glu突变型mbl蛋白的分子质量与抗原性经硫酸铵粗沉淀及两步亲和层析,从1l细胞培养上清中可得到约1mg蛋白。sds-page分析发现,在非还原状态下,37glu突变mbl蛋白在mr60000处有1条明显的带,在mr200000处见1条很弱的带,而重组野生型mbl蛋白则在mr>200000处可见多条明显条带,在60000处只有非常微弱的条带。westernblot结果显示,37glu突变型mbl蛋白在mr60000处呈现1条能与抗his抗体反应的条带,而重组野生型mbl蛋白的染色带则主要在mr>200000处（图3）。elisa表明,重组37glu突变mbl蛋白能为抗his、mbl-crd或mbl的mab所识别（图4）。

图3sds-page和westernblot分析纯化的重组表达产物（略）

1:蛋白marker;2:重组野生型mbl;3:重组37glu突变型mbl;4:重组野生型mbl的westernblot图;5:重组37glu突变型mbl的westernblot图.

2.537glu突变型mbl蛋白的配体结合能力配体结合试验结果显示,37glu突变mbl蛋白无糖结合能力,而天然mbl和重组野生型mbl蛋白与甘露聚糖有良好的结合活性（图5）。

图437glu突变型mbl蛋白与抗体的结合(n=3)（略）

图537glu突变型mbl蛋白与甘露聚糖的结合(n=3)（略）

2.637glu突变型mbl蛋白与masp2-n端蛋白的结合能力结合试验显示,人天然mbl和重组野生型mbl蛋白对masp2-n端蛋白有良好的结合活性,但37glu突变mbl蛋白则否（图6）。

图637glu突变型mbl蛋白与甘masp2-n端蛋白的结合(n=3)（略）

2.737glu突变型mbl蛋白激活补体的活性重组野生型mbl蛋白能通过凝集素途径激活补体,裂解c4产生c4d,而37glu突变型mbl蛋白激活补体的活性几乎完全消失（图7）。

图737glu突变型mbl蛋白激活补体的作用(n=3)（略）

3讨论

人mbl肽链mr为27000~32000,3条肽链构成结构单位,完整的mbl分子是这种结构单位的寡聚体,多至六聚体［1,2］。mbl的结构如此复杂,在原核系统是无法表达的。因此,我们选用真核表达载体和哺乳动物细胞进行研究,以期模拟mbl基因在人类细胞中表达的情况。本实验选择真核表达载体pcdna4/hismaxc和cho细胞作为研究系统,构建的重组表达载体经dna测序确证mbl基因中含gga57gaa点突变,然后将其转染cho细胞中表达。真核表达的关键之一在于能否筛选到稳定高效的表达细胞株。由于pcdna4/hismaxc含有zeocin抗性基因,我们用zeocin持续加压转染细胞近2个月,最终筛选到5株稳定表达株。采用mab-sepharose4b和ni2+-ntaagarose层析法纯化37glu突变型mbl蛋白,效果比较满意,获得了较高纯度的目的蛋白。

已发现3个可引起免疫缺损的mbl结构基因点突变,但对其引起调理吞噬缺损的机制了解不多。我们先前的研究证明,mbl结构基因的3个点突变均不影响mbl蛋白的合成与分泌［5］,本实验成功地获得分泌性表达37glu突变mbl分子的cho细胞株和重组37glu突变mbl蛋白,亦表明gga57gaa点突变并不影响其产物的表达及向胞外分泌的过程。应用sds-page和westernblot分析,发现37glu突变mbl蛋白主要是mr60000的分子,这应该是mbl肽链的双体,其寡聚化程度大大低于重组野生型mbl,高寡聚化的mbl分子极少。这与我们对32arg［6］和34asp［7］突变蛋白的研究结果相似。功能实验发现,37glu突变型mbl蛋白不能与配体甘露聚糖结合,亦缺乏与masp-2n端蛋白结合的能力,从而导致其激活补体凝集素途径的活性几乎完全消失。mbl分子的寡聚化程度与其clr密切相关,而寡聚化程度直接影响其功能,只有四聚体以上的多聚体才具生物学活性［12］。因此有理由推论,因gga57gaa点突变产生的带有巨大侧链和电荷的glu代替了无侧链且电中性的gly,影响了3条肽链clrα-螺旋的形成,从而妨碍了mbl结构单位和/或寡聚体的装配,即产生了结构有缺陷的mbl分子,并进而影响其功能活性。同时亦表明,mbl肽链第57位gly残基对于维持完整mbl分子的结构和功能是必需的。

【参考文献】

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细胞生物学特性篇3

【关键词】口腔肿瘤;树突状细胞;表型；增殖

Biologicalcharacteristicsofmonocytederiveddendriticcellsfromperipheralbloodofpatientswithoralcarcinoma

【Abstract】AIM:Toinvestigatethemorphology，phenotypeandfunctionsofdendriticcell(DC)fromperipheralbloodofthehealthyinpidualsandthepatientswithoralcarcinoma.METHODS:FifteenpatientswithoralcarcinomaatstagesofIIorabovewereassignedtostudygroupand15healthyvolunteerstocontrolgroup.Monocyteswereisolatedbydensitycentrifugation，andculturedinthepresenceofGMCSF，IL4andTNFαfor7dinvitro.Themorphologicalchangeoftheculturedcellswasobservedbylightmicroscopyandelectronmicroscopy.TheexpressionsofCD83，CD1a，CD86，CD80，HLADRwereanalyzedbyflowcytometry.TheabilityofDCtostimulatetheproliferationoflymphocyteinmixedlymphocytereactions(MLR)wasdeterminedwiththemethodofMTT.RESULTS:MorphologicallyandphenotypicallytypicalDCwasobtainedinthe2groupsafterculturefor7d.TheexpressionratesofCD83，CD1aonDCfromthepatientswere49.3±9.5and48.1±7.3respectively，significantlylowerthanthosefromhealthyvolunteers(P0.05).Moreover，themeanfluorescenceintensityofCD83，CD1a，CD80，CD86andHLADRexpressedinstudygroupwere4.80±2.13，3.96±1.15，19.63±8.12，12.33±6.75and39.44±7.9，respectively，whichwerelowerbutnotstatisticallydifferentfromthecontrolgroup(P>0.05).Inaddition，DCfromthestudygrouphadtheabilitytostimulatetheproliferationofallogeneicandautogenouslymphocytesinvitro.CONCLUSION:MonocytesinperipheralbloodofthepatientswithoralcarcinomacanbeinducedtodifferentiateintomatureDCwiththeabilitytostimulatetheproliferationoflymphocytes，andsotheseDCmightbeusedinimmunotherapyfororalcarcinoma.

【Keywords】mouthneoplasms;dendriticcell;phenotyping;proliferation

【摘要】目的:研究口腔癌患者外周血树突状细胞(DC)的形态、表型和功能性变化及其临床意义.方法：口腔癌患者（实验组）及正常人（对照组）15例外周血单个核细胞经GMCSF，IL4及TNFα诱导培养，获取成熟DC，光镜和电镜观察细胞的形态，流式细胞仪检测细胞表型如CD1a，CD83，CD80，CD86和HLADR等分子的表达变化，用噻唑蓝（MTT）法检测DC与自体和同种异体的混合淋巴细胞反应（MLR）中对淋巴细胞增殖的刺激能力.结果：正常人及口腔癌患者的外周血单个核细胞经体外7d诱导培养，均诱导出具有典型形态和表型的DC，其中实验组细胞的CD83，CD1a表达率分别为49.3±9.5和48.1±7.3，与对照组两者表达率62.1±7.9和60.2±6.8相比，差异有统计学意义(P0.05);实验组DC细胞CD83，CD1a，CD86，CD80和HLADR表达的平均荧光指数(MFI)分别为4.80±2.13，3.96±1.15，12.33±6.75，19.63±8.12和39.44±7.9，均低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05);口腔癌患者来源的DC在体外具有诱导同种异体和自体外周血T细胞增殖的能力.结论：口腔癌患者外周血单核细胞来源可诱导成为具有功能性的成熟DC，该细胞可应用于口腔癌的免疫治疗.

【关键词】口腔肿瘤;树突状细胞;表型；增殖

0引言

目前，对口腔癌的治疗手段仍以手术为主，由于颌面部能提供的切除面积有限，有时很难实现距肿瘤边缘1.5cm清除病灶，而且手术本身造成的面部畸形严重破坏了患者的口腔功能和心理健康.因此，如何缩小手术范围、有效控制临近亚病灶及微小病灶的发展是亟待解决的问题.树突状细胞（dendriticcells，DC）是已知功能最强的抗原提呈细胞，并被认为是抗肿瘤免疫治疗的一种非常有前途的方法［1-3］，由于DC对T细胞的活化受MHC限制，故临床应用的DC细胞及其疫苗必须使用肿瘤患者自身来源的DC，那么从肿瘤患者的外周血单个核细胞中能否经过体外诱导产生出功能性DC，口腔癌患者与健康人DC细胞的表型及其抗原提呈分子的表达以及刺激淋巴细胞增殖能力有何不同，因此本研究旨在为临床以DC为基础的免疫治疗提供实验依据.

1材料和方法

1.1材料RPMI培养基(HycloneUSA)，淋巴细胞分离液(上海恒生公司)，重组人单核巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)，重组人白细胞介素4(rhIL4)，肿瘤坏死因子α(TNFα)均使用美国PeprotechAsia公司产品.取200505/200510来我院口腔科住院治疗的口腔癌患者15例作为实验组，本组病例均经术后病理证实；对照组为健康志愿者15例.两组人员均排除感染、糖尿病、血液病和自身免疫性疾病.

1.2方法无菌采集外周血50mL，肝素钠抗凝.加入等量无钙镁DHanks缓冲液（pH7.4），充分混匀.取50mL离心管加入Ficoll淋巴细胞分离液20mL后，再沿壁小心加入上述稀释的外周血20mL，2000r/min，20min离心，分离外周血单个核细胞.小心吸取中间层细胞，用DHanks洗涤细胞3次，弃上清，用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×1010个/L，接种于6孔培养板，每孔3mL.于50mL/LCO2，37℃条件下孵育2～3h后，吸出培养上清和非贴壁细胞（用于其他实验），用预热37℃的培养基清洗板1次，以去除非贴壁细胞，获得贴壁的单核细胞，加入含1MU/LrhGMCSF和0.5MU/LrhIL4的RPMI1640完全培养基于37℃50mL/LCO2进行培养，孵育至第5日时，每孔加入TNFα0.2MU/L，7d后得到成熟的DC［4］.诱导培养1，3，5，7d时用倒置显微镜观察细胞的形态变化及DC形成，在培养的7d收集DC，调细胞密度为1×107/L，分为两份，一份用10g/L戊二醛固定30min，梯度乙醇脱水，叔丁醇干燥，喷金，扫描电镜观察细胞形态.另一份用25g/L戊二醛固定，锇酸后固定，醋酸钠、柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察细胞超微结构.

1.2.1FACS测定细胞表型收集体外培养5，7和10d的外周血单个核细胞，台盼蓝染色，确定细胞活力在95%以上，分别加入直标荧光的，如PE标记的CD1a，CD86，HLADR，IgG1（对照），FITC标记的CD83，CD80，IgG2（对照），充分均匀染色(4℃，避光，30min)后FACS行细胞表型检测.

1.2.2混合淋巴细胞反应非贴壁细胞调整密度为2×109/L，加入96孔培养板中，分别按10∶1，20∶1和40∶1的比例加入上述培养的两组DC（保持T细胞数为105），该DC先用25mg/L丝裂霉素于37℃孵育45min，然后调整细胞密度为2×108/L，加入培养板各孔内，总体积200μL/孔，各实验组分设3复孔，混匀，同时设对照组.37℃，50mL/LCO2培养72h.于实验培养终止前4h，加入MTT液（5g/L）20μL/孔，混匀，继续培养4h，离心培养板（1000r/min，5min），弃上清，每孔加入DMSO（二甲基亚砜）150μL，充分混匀，静置数分钟，检测每孔490nm的A值，计算细胞培养指数［5］.增殖指数（SI）=试验孔A均值/对照孔A均值.

统计学处理：采用SPSS11.0软件包进行统计分析;两组样本均数的比较用t检验，多样本均数比较用方差分析，P

2结果

2.1培养DC的形态学特点人外周血贴壁细胞经体外诱导培养24h后，细胞聚集成大小不等的细胞聚体，3d可见细胞聚集成团，少量悬浮生长，部分细胞体积增大.5d悬浮细胞数量增多，细胞表面有细小突起形成.7d悬浮细胞或细胞团颜色变深，有明显树突状突起，扫描电镜观察，表面粗糙，胞体向周围伸出大量树枝状或裙褶状不规则突起.透射电镜观察，细胞表面伸出长短不一的突起，线粒体致密化，粗面内质网扩张成池状，溶酶体较少（图1），呈明显的DC细胞特征.

图1人外周血单个核细胞经体外诱导培养7dDC形态TEM×10000略

2.2体外诱导DC细胞的表型变化人外周血单个核细胞经体外诱导培养7d后，实验组（口腔癌患者）DC细胞的CD83和CD1a的表达率较对照组低，差异有统计学意义(P0.05);实验组DC细胞的CD83，CD1a，CD86，CD80和HLADR表达的平均荧光指数(MFI)虽然均低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05，表1）.

表1口腔癌患者外周血DC表面分子的表达比较（略）

2.3DC对淋巴细胞增殖反应的影响在自体和同种异体淋巴细胞反应体系中，随着DC比例增加，实验组和对照组淋巴细胞增殖能力均明显增强，实验组自体AMLR增殖均值由1.8升至3.2，健康人自体AMLR增殖均值由2.2升至4.1，差异有统计学意义（P

图2DC对T细胞增殖的影响略

3讨论

近年来，对实体瘤的免疫生物治疗称为肿瘤防治的研究热点，免疫防御机制用于头颈部癌的治疗已显示较好疗效［6］，而DC作为体内功能最强的专职性抗原递呈细胞（APC），能刺激未致敏T细胞的增殖和活化、启动机体的特异性免疫应答，在肿瘤免疫治疗中发挥着重要作用.人体内DC大多处于不成熟状态，激活淋巴细胞反应的能力较低，但具有极强的抗原内吞能力.在摄取抗原或接受某些刺激因素后DC可以分化成熟，由于体内DC数量少而且分布广泛，难以分离纯化，怎样通过简单有效的方法制备出大量的功能性DC来满足临床需要，是亟待解决的问题.

目前，体外培养的DC主要来源于外周血、骨髓和脐血.我们应用口腔癌患者和健康人外周血单个核细胞诱导DC的产生.因为外周血采集方法简单易行，容易获取，而且与骨髓相比不易污染肿瘤细胞.研究表明，在决定DC是否可以发育成熟的调控因素中，GMCSF，IL4和TNFα是极其重要的诱导因子，其中GMCSF可促进髓系细胞发育，是维持DC发育和分化的最根本的细胞因子；IL4可促进干细胞及单核细胞分化发育成DC，并维持DC于未成熟状态，使其具有很强的处理外源性抗原的能力［7］.在DC培养过程中加入TNFα可以促进DC成熟，使其具有强的刺激T细胞的活性，并抑制DC凋亡［8-9］.

我们对口腔癌患者及健康人外周血单个核细胞经GMCSF，IL4和TNFα3种细胞因子体外诱导分化，获得具有典型DC细胞形态特征的DC.经诱导培养至第7日时两组DC均高表达CD86，CD80，HLADR，差异无显著性，与文献［10］报道一致.而两组DC之间CD83和CD1a的表达率有明显差异.CD83是目前公认的成熟DC标志分子，我们考虑该差异源于两组PBMC的贴壁率和DC转换率不同.Onishi等［11］认为晚期肿瘤患者的单个核细胞来源的DC中存在一种叫短寿命的亚群，培养超过7d，较短命的亚群死亡，幸存的DC无论是表面分子表达、MLR和抗原提呈能力均与健康人相似.本实验结果显示，患者单个核细胞来源的DC在体外同样具有激发自体和同种异体外周血T细胞增殖的作用，并且随着DC数量的增加对淋巴细胞增殖能力刺激作用增强.我们认为，口腔癌患者来源的MoDC在初始状态可能与健康人有一定的免疫学差异，但是通过合理的因子组合培养后，同样能发挥针对自身疾病的免疫治疗作用，从而避免使用他人血源的排斥反应，怎样针对患者自身来源的DC特性选择更合适的培养手段，发挥它的特异性免疫治疗效果，尚需进一步研究.

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细胞生物学特性篇4

【关键词】骨髓间充质干细胞；生物学特性；细胞培养

TheBiologicalCharacteristicsandCultureinVitroofRabbitBoneMarrow-derivedMesenchymalStemCells

〔Abstract〕ObjectiveTofurtherstudytheisolationandcultivationproceduresofmesenchymalstemcellsfromrabbitinvitro，andexploretheirbiologicalproperties.TobuildanexperimentalbasisonapplyingMSCsasseedcellstotreatmanydiseases.Methods

MSCswereobtainedfromtibiasbydensitygradientcentrifugationandweretestedtherateofadhesion.Theconfigurationwasobservedunderphase-contrastmicroscopeconsecutivelyandthecellgrowthwasmeasuredbyMTTmethod.Cellcycleandsurfaceantigensweredetectedthroughflowcytometer.ResultsThesubculturedcellsshowedactiveproliferativeability.Morethan95%ofsubcelturedMSCswereadhesivein12h.MSCswerepositiveforCD29，CD44，CD105andnegativeforCD34.

Conclusion

Inpresentculturecondion，MSCsshowedstableandrapid

growthinvitro.ThecharacteristicsmakeitpossibletoMSCstobetheseedcellsfortissueengineering.

〔KeyWords〕

Mesenchymalstemcells;Biologicalcharacteristics;Cellculture

干细胞是具有自我更新能力，且在适宜微环境下具有多系分化潜能的原始细胞[1]。近年研究发现，机体内除胚胎干细胞外还存在具有自我更新和分化能力的成体干细胞。其中骨髓中的干/粒细胞包括间充质干细胞（Mesenchymalstemcells，MSCs），造血干细胞及网状内皮系统。MSCs可在体外扩增并有多向分化潜能[2-4]，且取材方便，免疫耐受性、遗传背景稳定及易于转染外源基因等，因而作为组织工程“种子细胞”有“广泛的应用前景”[5-8]。本实验通过对兔MSCs体外培养法及其生物学特性进行研究，以建立一套稳定、成熟的兔MSCs培养方法，从而为细胞移植等组织工程提供种子细胞来源提供实验基础。

1

材料及方法

1.1

主要试剂与仪器

低糖DMEM培养基（GIBICO公司）、10%胎牛血清（Hyclone公司）、0.125%胰蛋白酶（Sigma公司）、Ficoll淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司，比重1.077g/mL）、CD29、CD34、CD44、CD105单克隆抗体和FITC标记的二抗（Labvision）、MTT（沃宏公司）、倒置相差显微镜（OLYMPUS）、细胞培养箱（Forma）、流式细胞仪（FACSCalibur，BECTONDICKINSON公司，美国）及超净工作台（ESCO）等。

1.2

实验动物

普通级健康新西兰大耳白兔，雌性，兔龄约3个月（南京市第一医院动物实验中心提供，许可证号：SCXK[苏]2002-2007）。

1.3

方法

1.3.1

骨髓MSCs的分离纯化与培养

兔仰卧固定于兔台上，予2%利多卡因局麻后，持16号骨穿针，沿胫骨平台垂直刺入骨髓腔，外接肝素（3000U，0.2mL）润洗过的10mL无菌注射器，抽取骨髓4mL，缓慢叠于等量Ficoll淋巴细胞分离液（密度1.077g/mL）上，以2000r/min的速度离心20min，分离骨髓单个核细胞，收集界面上的细胞，移入另一离心管，PBS洗涤，2000r/min离心5min，反复2次，弃上清，悬浮于含10%胎牛血清的DMEM培养基（青霉素100U/mL，链霉素100U/mL），轻轻吹打均匀，接种到25cm2培养瓶，置37℃，5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。4~6d首次换液，以后每3d或4d换液1次，14~21d细胞生长融合达80%以上，以0.125%胰蛋白酶消化，按1:2比例传代培养，倒置显微镜下逐日观察细胞形态。

1.3.2

骨髓MSC贴壁率检测

取对数生长期细胞，0.125%胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/mL，接种于24孔培养板，每次孔1mL，每2h取出培养板，吸去4孔培养液，0.1mol/LPBS漂洗除去未贴壁细胞，0.125%胰蛋白酶消化后离心收集细胞，进行细胞计数，共观察12h，按以下公式逐个计算每个时相点的贴壁率：贴壁率=（贴壁细胞总数/接种细胞总数）×100%。

1.3.3

骨髓MSCs生长曲线的测定

取第3代生长良好的细胞，用0.125%胰蛋白酶消化后用含10%FBS的DMEM制备细胞悬液，以每孔103~104个细胞于不同时相分别接种于8块96孔板中的8孔，每孔体积200L，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中孵育。于第2天起行MTT比色法，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20L，37℃继续孵育4h后，每孔加入150L二甲基亚砜，振荡10min后选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，以时间为横轴，光吸收值A（OD）为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.3.4

骨髓MSCs表面标记测定

取第3代MSCs，用0.125%胰蛋白酶消化，2000r/min离心5min，PBS洗涤2次，调节细胞浓度为1×106/mL，分为4份，分别滴加人抗兔CD29、CD34、CD44、CD105一抗（以PBS代替一抗作为阴性对照），室温反应30min后，PBS洗涤2次，滴加FITC标记的抗兔IgG，避光反应15min后，经流式细胞仪检测细胞表面CD29、CD34、CD44、CD105阳性细胞的表达。

2

结

果

2.1

MSCs的形态学变化

原代培养中，可见细胞以分散、克隆集落方式增殖；第1~3天细胞大部分呈圆形、椭圆形生长；第3~7天贴壁细胞增多，并逐渐延展生长为多角形、星形或梭形；7~21d贴壁细胞明显增多，并有集落形成，相邻集落融合成片达80%以上，细胞排列呈漩涡状，细胞间界限不清，细胞呈长梭形；14~21d后，细胞传代，传代后的细胞不以集落方式生长，而是均匀分布长梭形细胞。

2.2

MSCs各时相点细胞帖壁率

见表1。

2.3

MSCs生长曲线分析

实验发现，细胞传代培养1~2d，吸光度变化不大，甚至有轻微下降，细胞处于潜伏期，第3天起呈对数生长，至第7天到达高峰，之后进入平台期，见图2。

根据计算细胞的倍增时间公式可得：

DT=t×〔lg2/（lgNt-lgNo）〕=96×〔0.301/（-0.060+1）〕=30.8h

2.4

MSCs表面标记

流式细胞仪结果显示：CD34、CD45阳性细胞均为0.8%；CD29和Cd105阳性细胞数为99.8%。说明分享获得的细胞符合骨髓间充质干细胞的特点（见图3）。

3

讨

论

MSCs体外培养的生长特点和生物学特性已有较多相关文献报道。MSCs在骨髓中的含量极少，约占有核细胞的0.001%~0.01%[9]，如何获得高纯度、足量的MSCs，成为MSCs应用研究的关键。

目前常用于MSCs分离方法有密度梯度离心法[10-11]、贴壁筛选法[12]、免疫磁珠法[13]、流式细胞仪分离法[14]及Hung等[15]研究的特制微孔培养板筛选法。采用全骨髓贴壁筛选法，将抽取的骨髓直接置于培养瓶中培养，利用骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性分离细胞，几天后换液观察细胞贴壁情况，这种保留造血干细胞和各种细胞混合培养的方法，由于维持了MSCs原始的生活环境，有利于MSCs分化，但所得细胞成分复杂，MSCs纯度不足。单克隆抗体磁珠分离系统或流式细胞仪技术对细胞活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性，而且实验操作复杂，需要骨髓量大，不易重复，造价较高，一般仅限于在大实验室应用[16]。特制微孔培养板筛选法，可以快速有效分离得到相对同质的MSCs，利用这种方法可以不用Percoll液去除红细胞[17]，但是结果不稳定，特定原料不易大量获取。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，利用Percoll或淋巴细胞分离液提取单核细胞进行贴壁培养。操作上较贴壁细胞分离法烦琐，得到的细胞数不如后者多，但细胞纯度较后者高。本实验结合密度梯度离心法和贴壁筛选法，利用密度为1.077g/L的Ficoll分离液，能有效去除绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板，获得纯度较高的单个核细胞。然后利用MSCs的贴壁性，逐渐弃掉未贴壁细胞，从而获得足量的MSCs。

在培养过程中，我们还注意到以下几个环节：①与蒋雯等[18]不同，本实验研究发现，兔MSCs原代培养首次换液的时间宜在4~6d，过早换液将丢失过多尚未贴壁细胞，因在实验过程中，第3天首次换液后，收集旧培养液离心洗涤，再接种仍有细胞大量生长；且原代细胞在培养14d~21d左右才能达到80%以上的融合，才能进行传代培养，这可能与我们用的培养基加的胎牛血清浓度不同，蒋雯等用的是20%的血清，而我们用的是10%的胎牛血清；②培养基中胎牛血清浓度保持在10%左右为宜，过低由于缺乏生长因子的刺激，细胞增殖减慢，而过高又因含大量促进细胞生长增殖分化的因子，易引起细胞过早出现老化；③兔MSCs原代接种贴壁不良时，可予胶原[19]包被培养瓶，增加细胞的贴壁率；④胰蛋白酶消化细胞时，可先将PBS润洗培养瓶2次，去除残留血清，更易将贴壁细胞消化下来，且消化时间缩短，不会造成消化时间过长对细胞的损伤；⑤细胞传代时，应注意接种密度，宜按1:2比例传代接种，如此细胞才能保持良好的增长趋势，不会因接种密度过稀致增长缓慢且易老化。

目前MSCs在生物医学领域有着广泛的应用，然而MSCs表面标志由于细胞分离、培养方法和培养时间等的不同而有差异。Pittenger等[20]认为人MSCs阳性表面标志是SH2（CD105）、SH3、SH4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD124，阴性表面标志是CD45、CD34和CD14等造血细胞标志。Hung等[21]采用带3m孔培养板的装置培养分离得到人MSC，培养至第2代末时阳性表面标志是CD90、CD44、CD29、CD51，阴性表面标志是CD45、CD34、CD7、AC133等。研究者们应用不同的分离扩增方法及不同的方式表达细胞特性，使得对一些研究结果的比较变得困难，阻碍了其在这些领域的应用[22]。因此在2005年，ISCT（theInternationalSocietyforCellularTherapy）定义了MSCs的最低标准：首先，MSCs在标准培养条件下必须具备贴壁生长的特点；其次，MSCs表达CD105、CD73和CD90，而CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a、或CD19及HLA-DR表面分子表达阴性；第三，MSC在体外能分化为格根包尔氏细胞、脂肪细胞和成软骨细胞[23]。本实验选择第3代细胞行流式细胞仪检测表面抗原显示，阳性表达黏附分子、整合素家族成员等如细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性细胞数占99.8%，而造血细胞表面标志阴性或极少表达即CD34阳性率只有0.8%，上述结果表明：获得的细胞为非造血类的、符合骨髓间充质干细胞的特点，与文献资料吻合[12，24]。

通过对兔MSCs培养方法和表面标识物的进一步研究，本研究建立了一套稳定分离、培养扩增骨髓间充质干细胞的方法，获得足量纯化的MSCs并进而研究其作为种子细胞治疗多种疾病提供了实验基础。随着基因工程和组织工程的发展，骨髓MSCs也将在细胞治疗、基因治疗等方面得到广泛应用。本研究设计的缺陷在于，这只是细胞培养的一个初步研究，下一步若对细胞周期及细胞活力进行检测，将对选择最合适代数细胞作为种子细胞的应用提供更有价值的信息。

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细胞生物学特性篇5

结合有丝分裂的内容，引导学生看课本插图P117图6-8红细胞和心肌细胞、P117图6-9各种植物细胞、P117图6-10分化的细胞可形成不同的组织和器官。

在学生看图的过程中展示图1。

引出细胞分化的概念，得出细胞分化的意义。

在个体发育中，相同细胞的后代，在形态、结构和功能上发生稳定性差异的过程。细胞分化是生物个体发育的基础。细胞分化过程中遗传物质没有变化，是基因选择性表达的结果。需要提醒的是细胞分化贯穿在整个生命周期中，不只出现在胚胎时期，为干细胞做铺垫。

分析得出细胞分化的特点：普遍性、持久性、稳定性、不可逆性。

接着，引导学生比较细胞分化与细胞分裂的区别。

通过对插图和表格的分析，使学生分清了细胞分化与细胞分裂的区别；了解了细胞分化的过程和特点；知道了细胞分化的生物学意义。

二、利用科学发展史了解科学的发展，正确看待科学技术对社会的影响

1.从科学发展史中学习科学与技术的关系

结合课本插图P118图6-12植物组织培养过程。通过对植物组织培养研究的历史发展过程的分析来总结科学发展的历史经验并揭示其规律。

1902年德国植物学家哈伯兰特（Haberlandt）提出细胞全能性概念，并用叶肉和其他多种细胞进行离体培养。在自制的营养物质中培养，仅出现一些细胞增大，未出现增殖和分化现象。

1934年荷兰植物学家（温特）F.W.Went发现了吲哚乙酸（IAA），随后又有人相继发现了IBA，NAA和2.4-D人工合成的生长素。

1934年怀特（White）用无机盐、糖类和酵母提取物配制成怀特培养基，用番茄根进行离体培养形成愈伤组织。其后证明了生长素和维生素对组培的作用，提出了细胞全能性学说。

20世纪40-50年代，斯库格（Skoog）和崔等人利用添加了腺嘌呤和生长素的培养基进行烟草培养，诱导根、芽等器官，并确定腺嘌呤和生长素诱导根和芽生长的作用。

1958年美国斯图尔德（Steward）等和德国赖纳（Reinert）等分别将培养的胡萝卜根细胞诱导形成了胚状体，形成新植株。用实验证明了植物细胞的全能性。

从以上植物细胞全能性的研究历史，我们可知培养基是影响成功的重要的因素，正是因为科学和技术的相互支持，才使组织培养技术能够获得成功和完善。

通过植物组织培养，我们可以获得大量的克隆体，保持优良特性，缩短生产周期。为我们的生活提供丰富的物质保障，如花卉和蔬菜培育。

2.科学与技术对社会的影响

植物细胞的全能性，引发了人们对于动物细胞是否具有全能性的猜想，经过许多科学家的努力，动物细胞的体外培育不能实现细胞的全能性。几经周折后，科学家终于通过细胞重组技术证明出了动物细胞核具全能性。因为细胞核具有生物体的绝大部分遗传物质。

证明动物细胞核具全能性的就是克隆技术，也称核移植。

1996年7月5日，世界上第一只克隆羊多利（Dolly）由英国爱丁堡大学的伊恩・维尔穆特博士培育成功，但这成功并不是利用一个细胞就实验成功了，而是利用了上千个卵细胞才成功一个，其中过程也是很复杂的，是科学理论的指导下进行的。

克隆可以用于造福人类，比如说治疗性克隆，利用胚胎干细胞进行器官移植。要是被别有用心的人利用，克隆也可以影响人类的正常秩序，那后果将不堪设想。比如说克隆优等人种组成军队统治世界。

所以，科学是技术发展的理论基础，技术是科学发展的手段。科学技术是社会进步的动力，然而科学技术的也会给人类带来负效应，应正确处理好科学技术和社会的关系。

三、与现实生活的联系，进行STS教育

本节课有个探究模块，就是干细胞的知识。课标要求学生能自主搜集资料，并与同学分享成果。通过查找资料让学生及时理解关注对科学、技术和社会发展具有重大影响的生物学新进展，激发学生学习生物学的积极性。

学生分享：移植弟弟脐带血治好血癌，3岁女童健康成长；姚明加入中华骨髓库等案例。

引导学生通过讨论得出：白血病就是骨髓中的造血干细胞在分化的过程当中出现问题，导致不能正常增殖、分化出血红细胞。我们可以用正常的造血干细胞替代有问题的细胞，达到治疗的目的。脐带血里含有造血干细胞，通过移植造血干细胞就可以慢慢恢复造血功能。

干细胞可以分为三大类：全能干细胞、多能干细胞，专能干细胞

这里的脐带血就是专能干细胞，可以分化成红细胞、白细胞等各类血细胞。

引导到目前人类遇到的重大科学难题――器官移植。器官移植需要先配型，后移植，移植成功后还需要终生服用抗免疫排斥的药。有没有能绕过免疫排斥的方法呢？那就是利用自身的干细胞培育出所需要的器官移植是最好的选择，它不会产生免疫排斥反应。

干细胞培育的方法还有望用于拯救珍稀、濒危动物。适当的介绍干细胞新进展，诱导多功能干细胞（iPS）的研究在生物和医学领域具有广阔的应用前景，有望成为实施再生医学和细胞治疗的重要细胞来源。

上述实例的介绍，让学生深刻体会到科学与技术对社会的影响力，从而激发学生强烈的好奇心和学习生物科学的兴趣。

四、课堂教学渗透STS教育的效果

我们将STS教育思想实施在具体教学的过程中，概念性的知识可以通过插图、绘图等手段，使学生更容易理解、掌握；技术性的知识通过科学发展史的学习，了解科学发展对人类的生活的作用，进而对科学萌生浓厚的兴趣；对于科学前沿知识应充分发挥学生的动手能力，查找相关的知识，讨论得出结果，再结合社会实际和学生的生活经验事例，将学习联系到现实生活中来，从而对内容进行加深巩固。

细胞生物学特性篇6

一、“细胞分化”概念内涵及层级

1.在个体发育中,由一个或一种细胞增殖产生的后代,在形态、结构和生理功能上会发生稳定性差异。细胞的这种特化不仅是正常发育所必需的,而且还能提高细胞各种生理功能的效率。

2.一般说来,体内各种细胞均含有物种的全部基因,但基因的表达具有时空性。细胞之所以在形态、结构和功能上发生稳定性差异,是因为组织特异性基因选择表达成了组织特异性蛋白的缘故。从理论上讲,已分化的细胞仍然具有发育成一个完整个体的潜能。

3.细胞分化是渐进性的,其方向的限定早于形态差异的出现,且分化细胞的表型保持相对稳定,一般不可逆转。

之所以采用完整的陈述句的形式来表述概念,是因为这种表述方式更易于确认需要学生理解和掌握概念的内容及意义,也更易于建立概念之间的联系。

二、“细胞分化”概念教学的组织

在分析“细胞分化”的概念内涵及层级之后,教学设计应该紧紧围绕着相应的概念条款展开,通过列举事实、分析讨论,或者基于资料的探究等活动,帮助学生深层理解这些概念内涵,并基于概念理解而构建合理的知识结构(见图1)。

1.列举事实,尝试定义。呈现人的受精卵发育至胎儿的图片:列举学生熟知的根尖分生区细胞分化成伸长区、成熟区的事实,然后,引导学生抽象概括出:“细胞分化是指在个体发育中,由一个或一种细胞增殖产生的后代,在形态、结构和生理功能上会发生稳定性差异的过程。”这是广大教师一贯坚持的做法,值得肯定。因为事实是用来帮助学生建立和理解概念的,事实当然要围绕着概念的结构来排布。但是,定义常常不等同于概念。“定义”通常用“是……”来表述,说得十分肯定。“概念”描述一类事物的本质,有时并不用“是”来描述。在引导学生下定义之后,教师还应该设置下列问题,吸引学生深入思考细胞分化的结果和生物学意义。①在人的个体发育过程中,假若没有细胞分化,受精卵能发育成胎儿吗?为什么?②细胞在形态、结构上出现特化,对于细胞完成其生理功能有何意义?③从遗传的角度分析,受精卵为什么能够发育成一个完整个体?问题3的设置实际上是指向“细胞全能性”这一核心概念的丰富内涵,之所以在此设置问题3,一方面是因为不仅已分化的细胞具有发育成完整个体的潜能,未分化的受精卵在自然条件下更容易发育成一个完整的个体。也就是说,“细胞全能性”这一概念是随着教学进程不断建构起来的;另一方面,其用意还在于探讨细胞分化的原因,起到承上启下的教学功效。

2.探究发现,明晰原因。美国地平线研究组(HorizonResearchTeam)主席维斯(Weiss)及高级研究助理帕斯利(Pasley)经过了18个月的观察,对364节课详细分析,发现优质课堂主要有几个特征,其中包括:①在课堂教学过程中,教师善用多种策略,为某个科学概念提供清晰的阐释;②吸引学生从事动脑筋的活动;③帮助学生理解学科的核心概念等。因此,可以引入相关科学史对细胞分化原因进行探讨。

资料1:最早试图对细胞分化机制作出解释的学者是Weismann(1883),他根据当时对马蛔虫的研究结果,提出了“体细胞分化是由于遗传物质丢失造成的,每一种组织只保留了其特有的遗传物质”的见解。在马蛔虫这一特例中,在卵裂过程中体细胞的染色体确实发生丢失现象。因此,Weismann这一观点在当时看来既符合逻辑,又有实际例证,因而被学术界所普遍接受。你同意上述观点吗?根据是什么?

资料2:1958年Steward等利用胡萝卜根的韧皮部组织培养出了完整的新植株;1970年Steward用悬浮培养的胡萝卜单个细胞培养成了可育的植株。

资料3:1969年Nitch将烟草的单个单倍体孢子培养成了完整的单倍体植株。

分析资料2和资料3,你得出的结论是什么?基于对上述3则资料的分析探究,学生就容易得出以下结论:①高度分化的植物体细胞,遗传物质并没有丢失,仍含有发育成一个完整个体所需的全套基因,具有发育的全能性;②在二倍体染色体组中,只要有一套单倍体的基因组,就含有该物种的全部遗传信息,因此,植物的生殖细胞也具有发育的全能性。至此,细胞全能性的概念内涵已昭然若揭,师生共同归纳(见图2)。学生仍然会有2个疑问:①既然已分化细胞中含有相同的遗传信息,为什么细胞的形态、结构和生理功能会出现稳定性差异?②已分化的动物细胞是否也像植物细胞那样具有发育的全能性?针对疑问1,教师可以列举事实,循循善诱,问题指向要明确,最终让学生领悟“细胞分化是组织特异性基因表达的结果”。例如:通过分子杂交实验表明,在任何时间一种细胞的基因组只有一少部分基因在活动。在幼红细胞中,糖酵解酶系的编码基因、核糖体蛋白基因是否均能表达?血红蛋白基因、胰岛素基因是否都能表达?细胞的形态、结构与生理功能主要由哪种化学物质直接体现?幼红细胞最终分化成红细胞的主要原因是什么?针对疑问2,教师要向学生说明:到目前为止,人们还没有成功地将单个已分化的动物体细胞培养成新个体,这是因为动物细胞的发育潜能随着分化程度的提高而逐渐变窄。但这种分化潜能的变化是对细胞整体而言的,对细胞核来说是否还保持着全能性呢?进而引导学生分析细胞核移植实验。

3.因果分析,把握特征。学生一旦理解了细胞分化的因果关系,就容易从中把握细胞分化的特征:①渐变性——细胞在发生形态差异之前的一定时间,细胞分化命运即已确定,基因活动模式已发生改变,从基因到蛋白质再到细胞形态、结构、功能特化是一个渐变过程。②不可逆性——分化细胞的表型保持相对稳定,以执行特

定的功能。然而,在某些条件下,分化细胞的基因活动模式可发生可逆的变化,又回到未分化状态。