细胞遗传学检验范文

【关键词】间隙连接蛋白；CX26；内质网应激；凋亡

耳聋是引起交流障碍最常见的疾病，新生儿中先天性重度以上耳聋的发病率高达1-3/1000，其中一半是遗传因素所致。遗传性耳聋中约30%是综合征性聋，约70%属于非综合征性聋。在非综合征性聋中，常染色体显性遗传（DFNA）约占15%，常染色体隐性遗传（DFNB）约占80%，X连锁遗传（DFN）约占3%-5%，线粒体基因突变母系遗传约为1%。在DFNB中，约占50%以上患者是由GJB2（Connexin26，CX26）基因缺陷所致。GJB2基因缺陷还与常染色体显性遗传性聋（DFNA）和综合征性聋有关，是最常见的耳聋基因[1]。在GJB2基因中，已发现100余种突变与耳聋有关（http：//davinci.crg.es/deafness/），该基因的突变具有种族和地域特征。在高加索人种中，约50%的遗传性非综合征性聋是GJB2突变所致，编码区第35位鸟苷酸缺失（35delG）占该基因总突变的50%-86%，犹太人的突变热点是167delT，我国和日本等东亚人中最常见的突变是235delC[2-3]。GJB2基因编码的间隙连接蛋白26（Connexin26，CX26）是间隙连接蛋白家族中重要的一员，在内耳中是K+和IP3等第二信使分子的通道，对听觉生理和病理，具有重要作用[4]。

我们以往的研究在中国人群中发现的一个新突变，该突变为无义突变（c.465TA），导致155位脯氨酸变为终止密码子（155Tyrstop）[5]。同时我们的研究也显示截短突变后的Y155X蛋白聚集于内质网，不能正确定位到细胞膜中[5]。我们探讨异常聚集于内质网的Y155X突变体的可能的致病机制，我们在体外对Y155X突变体进行了过表达，检测内质网应激可能导致的细胞活性氧物质（ROS）的改变和对内质网应激诱导剂的敏感性改变情况。

1材料与方法

1.1材料蛋白电泳及转膜设备购自Bio-Rad公司，CO2配养箱购自Forma公司，ECL试剂盒购自GE公司，Lipofectamine2000购自Invitrogen公司，胎牛血清（FBS）购自GIBICO公司，Anti-myc单克隆抗体、Anti-β-actin单克隆抗体均购自sigma公司，Annix-V+PI凋亡检测试剂盒和DCF-DA购自Sigma公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG购自KPL公司，HEK293细胞株由医学遗传学国家重点实验室冻存。pCDNA3.1-CX26-Y155X-myc和pCDNA3.1-CX26WT-myc质粒为我们前期工作中构建。

1.2方法

1.2.1质粒转染按常规方法将HEK293细胞进行培养。HEK293细胞胰酶消化后按每孔2.5×105细胞数接种12孔板孔中，用DMEM+10%FBS培养于37℃，5%CO2培养箱中。待细胞生长至70%-80%汇合时进行转染，细胞转染的具体操作按Lipofectamine2000说明书进行，转染后24小时换液。

1.2.2免疫印迹使用2×SDSSamplebuffer裂解细胞10min，超声5s×3次（无需100℃变性）。使用BCA蛋白定量试剂盒进行定量，取20μg总蛋白上样（20μg/孔）。根据分子克隆所示方法制备8%SDS-PAGE分离胶，5%堆积胶，以80V恒压电泳。290mA，转膜2h，封闭液（5%脱脂牛奶/PBS）封闭1小时。5%BSA/PBS稀释的Anti-GFPmouseantibody室温孵育1h（1：5000）。0.1%TritonX-100/PBS洗膜10min×2次。5%BSA/PBS稀释的Anti-mouseIgG-HRPantibody室温孵育1h。0.1%TritonX-100/PBS洗膜10min×3次，按ECL说明书配制ECL液，孵育膜5min。暗室中显影。

1.2.3ROS检测转染24小时后，消化细胞，用培养基重悬，加入20μMDCF-DA（Sigma，D6883）置于37℃静置30分钟。DCF-DA标记后将细胞2000×g离心10分钟（，用培养基重悬，进行流式细胞仪（Beckman-CoulterMoFLoXDPcellsorter）分析。计算平均荧光强度。以空质粒对照组的平均荧光强度作为100%，计算相对值。以3次独立实验的结果进行统计。

1.2.4流式细胞计数检测细胞凋亡HEK293细胞进行转染24小时，使用2mg/ml的tunicamycin处理细胞12h，用常规方法将12空板中的每一孔培养细胞（约1×106/ml）重悬于DMEM+10%FBS培养基中；用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集细胞；加入500μl的BindingBuffer悬浮细胞；加入5μlAnnexinV-FITC混匀后，加入5μlPropidiumIodide，混匀；室温、避光、反应5-15min。1消失内，进行流式细胞仪的观察和检测。用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488nm，发射波长Em=530nm。AnnexinV-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光通过PI通道（FL3）检测。每个实验重复三次取平均值。

1.2.5统计学分析利用SPSS14.0统计软件进行分析。均数间的比较采用方差分析、独立样本t检验，数据以均数±标准差（χ±s）表示。P

2结果

2.1免疫印迹鉴定CX26野生型和Y155X突变体的表达由于我们构建的质粒为突变CX26与myc标签融合质粒，因此可以采用myc的抗体来检测突变CX26的表达情况。由图1可见：野生型CX26和Y155X突变体都检测到了条带，且Y155X条带较野生型低，这表明蛋白已截短。

HEK293细胞中转染pCDNA3.1-CX26-Y155X-myc，pCDNA3.1-CX26WT-myc质粒和空载体。Myc抗体检测CX26的表达。内参为actin。

2.2CX26-Y155X导致ROS产生增多为了探讨CX25突变体Y155X可能的致病机制，我们使用2’，7’-Dichlorofluorescindiacetate（DCFH-DA）检测细胞内ROS的水平。过表达Cx26-Y155X的细胞内ROS的水平显著高于过表达野生型Cx26的细胞和空载体细胞（图2）。而过表达野生型CX26与空载体组ROS水平无统计学差异。这表明，过表达突变体Y155X蛋白能导致细胞内ROS水平增加，可能导致细胞死亡。

HEK293细胞中转染pCDNA3.1-CX26-Y155X-myc，pCDNA3.1-CX26WT-myc质粒和空载体。ROS水平以空载体组进行标化（100%）。CX26Y155X组与空载体和WT组相比具有统计学差异。**：p

2.3CX26-Y155X增加细胞对内质网应激诱导剂的敏感性我们以前的研究结果显示，CX26-Y155X突变体聚集在内质网，可能导致内质网应激从而诱导细胞凋亡，我们在体外检测了加入内质网应激诱导剂tunicamycin后，细胞对药物诱导凋亡的敏感性，使用流式细胞技术方法检测细胞的凋亡改变。结果显示，加入tunicamycin后CX26Y155X突变体对其敏感性增加，导致细胞凋亡。而野生型组和空载体组在该剂量诱导下，无明显的凋亡改变（图3）。

HEK293细胞中转染pCDNA3.1-CX26-Y155X-myc，pCDNA3.1-CX26WT-myc质粒和空载体。加入Tunicaymcin处理后，检测细胞凋亡情况。control为溶剂组。CX26Y155X组与空载体和WT组相比具有统计学差异。**：p

3讨论

我们以前的研究CX26的某些突变（p.R32H、p.R143W、p.R165W、p.L214P、p.Y155X、p.L214P、c.631-632delGT、c.572delT、c.235delC、35delGT）散在分布于细胞浆中，不能定位到细胞膜形成功能性间隙连接斑。并聚集于内质网，且高尔基体无分布[5]。尤其是我们新报道的突变p.Y155X聚集于内质网，提示这个CX26突变蛋白失去了从内质网被转运的细胞膜的功能，其原因可能与突变导致CX26的蛋白构象发生改变有关，这种改变引起了内质网应激和未折叠蛋白反应，或者是突变蛋白不能与从内质网转运的细胞膜的微管系统结合，最终导致细胞运输障碍，甚至引起细胞死亡。异常突变蛋白的在内质网的聚集能导致未折叠蛋白反应引起内质网应激和引发细胞死亡[6]。

蛋白质在内质网中折叠的过程伴随着活性氧簇（ROS）的产生，细胞通过谷胱甘肽（GSH）来清除这一过程中生成的ROS。当大量突变蛋白合成后，其不能正确的折叠，在分子伴侣的作用下，错误形成的二硫键被打开而再次形成二硫键，此过程会造成过多的ROS生成，这是内质网来源的ROS[7]。另外，内质网应激时，线粒体来源的ROS也会增加，其机制尚未阐明，可能与内质网钙离子释放和线粒体摄取钙有关[8]。在本研究中，我们对内质网应激可能能产生的ROS进行检测，结果显示表达Cx26Y155X的细胞ROS显著增加，同时也增加了对内质网应激诱导剂的敏感性。这些结果提示，CX26Y155X突变体由于异常聚集于内质网从而导致内质网应激，诱导ROS产生增多，对环境因素诱导的内质网应激更加敏感，从而增加细胞的凋亡。对遗传性耳聋最重要的致病基因—CX26突变筛查和功能的深入研究，将有助于对可能患有先天性听力损害的胎儿进行产前咨询和产前诊断，对患者和家属给出尽可能多的建议。对CX26的研究也将帮助我们更好的了解其他间隙连接通道的功能，理解其在其他疾病中的发病机制。

参考文献

[1]PicciottiPM，PietrobonoR，NeriG，PaludettiG，FetoniAR，CianfroneF，PomponiMG（2009）CorrelationbetweenGJB2mutationsandaudiologicaldeficits：personalexperience[J].EurArchOtorhinolaryngol，2009，（266）：489-494.

[2]SohlG，WilleckeK（2004）Gapjunctionsandtheconnexinproteinfamily[J].Cardiovascularresearch，2004，（62）：228-232.

[3]BroichG，PagliariA，OttavianiF（1997）Esthesioneuroblastoma：ageneralreviewofthecasespublishedsincethediscoveryofthetumourin1924[J].AnticancerRes，1997，（17）：2683-2706.

[4]KennesonA，VanNaardenBraunK，BoyleC（2002）GJB2（connexin26）variantsandnonsyndromicsensorineuralhearingloss：aHuGEreview[J].GenetMed，2002，（4）：258-274.

[5]XiaoZ，YangZ，LiuX，XieD（2011）ImpairedmembranetargetingandaberrantcellularlocalizationofhumanCx26mutantsassociatedwithinheritedrecessivehearingloss[J].ActaOtolaryngol，2011（131）：59-66.

[6]EvansWH，MartinPE（2002）Gapjunctions：structureandfunction（Review）[J].MolMembrBiol，2002（19）：121-136.

细胞遗传学检验范文

实验方案包括实验题目、实验的理论依据、实验的基础要求、详细的实验步骤、可能遇到的困难及解决方案、预期的实验结果、老师的评审意见。实验方案经老师讨论批准后，学生按实验方案所需的材料、试剂和仪器等用品申请单，主管教学老师审批签字后，交实验带教老师购买，领取实验用品后按照实验方案开始实施实验，对实验过程中存在的问题及时调整，小组内讨论，必要时请老师帮助解决。认真做好原始数据的记录，对实验结果进行统计分析，最后完成实验报告。

在专业课的自主设计性实验中，我们综合细胞生物学、遗传学、生物化学等系统理论基础，利用组织细胞培养技术、形态学技术、生物化学检验技术、分子生物学技术，结合临床检验基础、临床血液学检验、临床免疫学检验及临床微生物学检验等其他医学检验专业课的知识，设计实验方案，遵循科学性、自主创新性、可行性、实用性”的原则，设计了一系列实验，如人外周血淋巴细胞的培养及染色体G－显带制备方法、成纤维细胞生长因子21影响因素、烯霉毒素诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究、新生豆芽中酶含量的测定、洗涤剂中磷含量的测定、维生素C及抗生素对血液及尿液生化物质测定的干扰、竹纤维物品抑菌作用、林蛙油对肝纤维化的影响的组化免疫，这些自主设计性实验无论是在临床检验工作中还是在医学科学研究中都是一些基础实验，同时也贴近生活，富有意义。自主设计实验不仅激发了我们主动参与实验的热情，培养创新意识，提高动手操作和独立思考的能力，把所学的知识运用到实践中，融会贯通，而且通过小组内成员的团结协作、相互配合，培养了团队意识，增强了医学检验专业学生的责任感和主人翁意识，在整个实验过程中，小组内的每个成员都努力完成自己的任务，这一点对于我们今后的学习工作有着重要的意义。

在自主设计性试验中，我们充分利用已掌握的知识和技能对自己感兴趣的题目自主设计，亲自动手，从平时被动地按照实验指导机械地完成实验操作转变为主动设计实施实验，最终得到实验结果，分享实验成功的喜悦。同时我们将实验结果发论文形式报告并向杂志投稿，有的一个实验小组发表了4篇文章。我们小组在自主设计性实验中，选择了人外周血淋巴细胞的培养及染色体G－显带制备方法”这个题目，确定了实验题目后，我们通过查阅文献资料，初步拟定了实验方案，经指导老师的审阅和修改后，进一步完善实验方案。这个实验主要利用细胞培养技术和形态学技术，而且所需的实验器材与试剂、仪器设备实验室都能够提供。染色体显带技术在临床中对于遗传性疾病和恶性血液病的诊断举足轻重，临床上已用于疾病的诊断、分型、治疗方案的选择，在预后判断和微小残留病灶的检测方面发挥着越来越重要的作用，然而在遗传学和临床血液学检验实验课中却没有安排这一实验，所以我们选择本实验来补充我们检验专业的基础技能实验。在充分完成实验准备(包括试剂的配制、器材的清洗和高压灭菌)后，分别采集小组成员的静脉血加入植物凝集素在体外培养，72h后加入秋水仙碱应用液后经离心、低渗处理、固定、Giemsa染色后在显微镜下观察淋巴细胞有丝分裂中期的染色体。当小组成员在显微镜下看到自己的染色体时，兴奋、自豪和喜悦的心情无以言表。

21世纪是生命科学的世纪，而分子生物学是当今生命科学研究领域的前沿与核心，在分子水平上揭示生命现象的本质有力地推动了生命科学向前发展。分子生物学研究的基础就是染色体中的遗传物质，之前的许多课程都已经接触到了染色体，但一直都停留在感性认识，通过这次实验我们有了切身的体会:一条小小的染色体竞包含了庞大的遗传信息，控制着复杂而精细的生命活动，生命的奥秘如此神奇。在这一实验中，我们没有采用先经过淋巴细胞分离后再进行培养这一步骤，大胆创新，直接将静脉全血在体外培养以获得有丝分裂中期的细胞，考虑到淋巴细胞占外周血的比例非常少，而且分离步骤繁琐，尚需要分离液，分离效果不佳，容易丢失，最终导致实验失败。通过简化实验步骤，节约了实验成本，取得了预期的实验结果。自主设计性实验以学生为主体，在老师的指导下，设计并实施自己的实验方案。通过自主设计性试验，丰富了我们专业实验课程，充分调动了我们学习的积极性和主动性，培养创新思维，提高我们的综合素质和团队协作精神，使我们初步具备了科研能力和科学素养，让每一个同学都获益匪浅。

作者：霍毅明盛金李俊尹彬彬郝峰王杰李艳单位：吉林医药学院检验学院

细胞遗传学检验范文篇3

【摘要】目的采用小鼠淋巴瘤细胞试验(MLA)和小鼠骨髓微核试验(MNT)研究麦冬水煎剂的遗传毒性。方法在MLA中，3.36、6.73、13.45、26.90mg(原药材)/mL4个浓度组在非代谢活化(-S9)和代谢活化(+S9)条件下与L5178Y细胞作用3h，表达2d，制备突变频率平板并培养12d，计数大、小细胞集落的孔数，计算总突变率(MF)和小集落突变百分率(SC%)；在MNT中，每组10只ICR小鼠，雌雄各半，13.35、6.68、3.34g(原药材)/kg3个剂量组间隔24h灌胃给药2次，制作骨髓涂片，计数每只小鼠2000个嗜多染红细胞中含微核的嗜多染红细胞数，计算每组动物嗜多染红细胞微核率的平均值。结果MLA4个浓度组在+/-S9条件下诱发的MF呈现剂量相关性增加，与阴性对照组比较有统计学意义(P＜0.01)，SC%与阴性对照组相仿；MNT各剂量组未显示骨髓抑制作用，诱发的微核率与阴性对照组比较未见明显增加。结论麦冬水煎剂在+/-S9条件下均可诱发L5178Y细胞tk位点突变，提示其可能存在诱变物质；但该供试品对小鼠骨髓细胞染色体无损伤，经体内代谢活化后未显示遗传毒性作用。

【关键词】麦冬水煎剂；淋巴瘤细胞试验；骨髓微核试验；遗传毒性；小鼠

Abstract：ObjectiveToinvestigategenotoxicityofRadixOphiopogonisdecoctionbyMouseLymphomaAssay(MLA)andMouseBoneMarrowMicronucleusTest(MNT).MethodsInMLA，fourdoselevelsof3.36，6.73，13.45，26.90mg(crudedrug)/mLwasexposedwithL5178Ycellsfor3hourswithandwithoutmetabolicactivation(+/-S9)，thenexpressedfor2days.Themutationfrequencyplateswerepreparedandincubatedfor12days.Colonysizeineachplatewasscored，andthetotalmutationfrequencyandthepercentageofsmallcolonymutantswerecalculatedandanalyzed.InMNT，containedthreegroupsof3.34，6.68，13.35g(crudedrug)/kgand10ICRmice(5males/5females)ineachgroup，themiceweregivenevery24hoursbyoralgavagetwiceandsacrificedafter24hoursofthelastdosing，bothfemurboneswerecollectedtopreparethesmear.Foreachmouse，thenumberofmicronucleatedpolychromaticerythrocytes(MNPCE)in2000polychromaticerythrocyteswascounted，andthemeanrateofMNPCEineachgroupwascalculated.ResultsInMLA，thetotalmutationfrequencyofdoselevelsshowedadose-dependentincrease，therewasstatisticalsignificant(P＜0.01)comparedwithnegativecontrol，andthepercentageofsmallcolonymutantswassimilarwithnegativecontrolintheabsenceandthepresenceS9.InMNT，thedecoctiondidnotshowinhibitoryeffectforbonemarrow，andtherateofMNPCEinducedineachgroupdidnotshowsignificantincreasecomparingwithnegativecontrol.ConclusionRadixOphiopogonisdecoctioncaninducetkgenemutationinL5178Ycellswithandwithoutmetabolicactivation，ithintsthatthetestarticlemayhavepotentialgenotoxicityforhumanbodies.RadixOphiopogonisdecoctiondidnotshowchromosomedamageofbonemarrowcellsinICRmice，ithasnogenotoxicityinvivowithmetabolicactivation.

Keywords：RadixOphiopogonisdecoction；lymphomaassay；bonemarrowmicronucleustest；genotoxicity；mice

麦冬具有养阴生津、润肺清心的功效，用于肺燥干咳、虚劳咳嗽、津伤口渴、心烦失眠、内热消渴、肠燥便秘及咽炎等多种疾病的治疗。为使麦冬列入法国药典，进入法国销售市场，笔者受中法草药工作组之托、按照合作项目要求，在GLP管理体制下[1]，采用国内外遗传毒性试验指导原则[2-3]推荐的标准组合中的小鼠淋巴瘤细胞试验(MLA)[4]及小鼠骨髓微核试验(MNT)[5]对麦冬水煎剂进行了遗传毒性研究。

1材料

1.1供试品

麦冬原药材由中国药品生物制品检定所中药室采购，水煎剂由北京同仁堂科技发展股份有限公司制备。麦冬水煎剂为棕色液体，试验前于4℃冰箱、避光保存。MLA检测用原液浓度为2.69g(原药材)/mL；MNT检测用原液浓度为2.67g(原药材)/mL。

1.2阴性(溶媒)对照品

MLA使用本中心PWU-400超纯水机生产的超纯水，121℃、15min高压灭菌，4℃冰箱保存；MNT使用市售氯化钠注射液，批号07070641，购自天津药业焦作有限公司。

1.3阳性对照品

MLA的非代谢活化(-S9)试验使用甲基甲烷磺酸酯(MMS，批号12K3671)；代谢活化(+S9)试验及MNT使用环磷酰胺(CP，批号91K1176)；均购自Sigma公司。

1.4细胞

小鼠淋巴瘤细胞L5178Ytk+/--3.7.2C，引自日本国立医药品食品卫生研究所，液氮保存；细胞复苏后进行了支原体检查及自发突变细胞清除和自发突变率检测，合格细胞传代5次以内使用。

1.5动物

ICR小鼠50只，雌雄各半；微生物级别：VAF；北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK(京)2007-0001。动物购入时周龄：7～8周；体重：雌21.8～26.4g，雄27.1～31.5g；动物购入后于本中心动物管理室检疫驯化5d。

1.6培养基、试剂与染液

小鼠MLA使用：①完全培养基由RPMI1640培养基(GIBCO)、0.2%w/vNaHCO3(北京化学试剂公司)、1%青链霉素混合液(KeyGEN)、丙酮酸钠(Amresco，终浓度200μg/mL)配制而成，根据用途不同分为含10%马血清(传代培养)、含20%马血清(96孔板培养)和不含马血清(清洗、稀释)的培养液。②突变选择剂三氟胸苷(TFT，终浓度3μg/mL)，批号41K1144，购自Sigma公司。③代谢活化剂S9(由苯巴比妥钠与β-萘黄酮联合诱导处理大鼠肝而获得，本中心自制)，实验当日与180mg/mL的Glucose-6-Phosphate、25mg/mL的NADP、0.15mol/L的KCl等辅助因子溶液，按2︰1︰1︰1(mL)的比例配制成S9混合液，1h内使用。S9在处理液中的终浓度为2%。

小鼠MNT使用：①胎牛血清(天津市川贝生化制品有限公司)；②甲醇(北京化工厂)；③GiemsaStain(Sigma)，临染色前用1/15mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)配制3%Giemsa应用液；④吖啶橙(Fluka)，临染色时将0.1%吖啶橙染液与1/15mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)按1∶15的比例配制成应用液。

转贴于2方法

2.1小鼠淋巴瘤细胞试验

参考文献[5，7-8]方法，以供试品原液浓度，即终浓度26.9mg(原药材)/mL作为最高测试浓度，再设13.45、6.73、3.36mg(原药材)/mL共4个浓度组，同时设阴性对照组(1%超纯水)和阳性对照组(-S9：MMS，终浓度10μg/mL；+S9：CP，终浓度2μg/mL)，每组平行2支处理管，每管20mL处理液在-S9、+S9条件下检测。各组处理液与对数生长期的细胞于37℃振荡培养箱中作用3h，然后置37℃、5%CO2孵箱培养表达2d，期间每日进行细胞计数及密度、增殖率(DCG1、DCG2)的计算，进而求算相对悬浮生长率(RSG)；表达d0、d2，各组制备检测平板效率PE0、PE2的96孔平板各2块(阴性对照组4块)，置37℃、5%CO2孵箱培养11～12d，培养结束计数含细胞集落的孔数，计算PE0和PE2、细胞相对存活率(RS0和RS2)、总相对生长率(RTG)；表达d2各组制备检测突变频率的96孔平板各4块(阴性对照组8块)，置37℃、5%CO2孵箱培养12d，培养结束分别计数含大集落(LC)、小集落(SC)和大小集落(LC/SC)并存的孔数，计算总突变率(MF)及小集落突变百分率(SC%)；采用“Poisson分布两样本均数的比较”对组间微核率进行统计学分析以协助对结果的判断。

2.2小鼠骨髓微核试验

参考文献[5，8]方法，以供试品的最大技术给药浓度13.35g(原药材)/kg为高剂量组，6.68、3.34g(原药材)/kg分别为中、低剂量组，剂量分别是《中华人民共和国药典》(一部)[9]推荐的每日最大人用量的66.75、33.38和16.69倍，同时设立氯化钠注射液阴性对照组和CP(40mg/kg)阳性对照组；给药体积均为10mL/kg。给药首日采用分层随机化分组法分组，每组10只小鼠，雌、雄各半，首次给药时动物体重：雌25.2～28.7g，雄32.4～36.4g。各剂量组及阴性对照组间隔24h灌胃给药2次，末次给药24h后处死动物；阳性对照组单次腹腔注射给药，24h后处死动物。采用CO2吸入法将动物处死后即取双侧股骨，用胎牛血清将骨髓冲下，涂片，甲醇固定，Giemsa、吖啶橙分别染色；采用盲法制、阅片。显微镜下计数每只动物的Giemsa染色标本中200个总红细胞(ERY)所含的嗜多染红细胞(PCE)数，计算每组动物PCE/ERY比例的平均值与标准差，求算给药组PCE/ERY的比例与阴性对照组的比率；荧光显微镜下计数每只动物的吖啶橙染色标本中2000个PCE中含有微核的PCE数，计算每组动物的嗜多染红细胞微核率(MNPCE‰)的平均值与标准差，采用“Poisson分布两样本均数的比较”对组间微核率进行统计学分析，以协助对结果的判断。

3结果

小鼠淋巴瘤细胞试验结果见表1、表2。表1、表2示：+/-S9条件下各浓度组的细胞生存率均在40%以上；4个浓度组诱发的MF呈现剂量相关性增加，与阴性对照组比较有统计学意义(P＜0.01)；SC%与阴性对照组相仿；阴性对照组的PE0、PE2、MF均在本试验室的背景数据范围内(PE0：50%～150%；PE2：90%～200%；MF：150×10-6～300×10-6)；阳性对照组诱发的MF与阴性对照组比较有统计学意义(P＜0.01)，并以小集落突变体为主。表1-S9条件下麦冬水煎剂小鼠淋巴瘤细胞试验结果（略）注：RSG%＝(DCG1×DCG2)treatment/(DCG1×DCG2)N.C；DCG1＝细胞密度d1/细胞密度d0；DCG2＝细胞密度d2/细胞密度d1；PE0(2)＝-ln(EW/TW)/1.6，EW：emptywell；TW：totalwell；RS0(2)＝(PEtreatment/PEN.C)×100%；RTG＝RS2×RSG×100%；MF(×10-6)＝-ln(EW/TW)/2000/PE2；SC%＝(SC+SC/LC)/(LC+SC+SC/LC)×100%；与阴性对照组比较，*P＜0.01(下同)表2+S9条件下麦冬水煎剂小鼠淋巴瘤细胞试验结果（略）

小鼠骨髓微核试验结果见表3。表3麦冬水煎剂小鼠骨髓微核试验结果（略）

4讨论

MLA是一种具有高灵敏度、能够检测tk基因突变和染色体畸变两类终点的体外致突变试验，在国际上受到广泛应用。一般认为，大集落突变体的基因损伤多局限于胸苷激酶tk+/-位点，即小范围的点突变；小集落突变体是由较大范围的染色体改变(染色体断裂、缺失、重组或分离异常等)所致。本试验结果表明，麦冬水煎剂在+/-S9条件下均可诱发L5178Y细胞tk+/-位点突变，但活化后的致突能力有所减弱。提示麦冬内可能存在诱变物质。MNT显示，麦冬水煎剂对ICR小鼠骨髓细胞染色体无损伤效应，表明其经体内代谢后无明显遗传毒作用。MNT是传统而经典的检测染色体断裂剂、纺锤体毒物及非整倍体诱导剂的体内致突变试验。体内试验具备与人体应用相关的吸收、分布、代谢、排泄等，其中体内代谢相对于体外试验中的代谢系统与人体更具有相关性。

对于麦冬水煎剂，本研究得到体内试验阴性而体外试验阳性的结果，这种差异可能来自体内外试验生物系统、代谢途径等差异：体外形成的代谢产物未必在体内形成；活性代谢产物可能在体内迅速被解毒而体外则不能；受试物在体内可迅速、有效地被排泄等[4]。

笔者还曾采用Ames试验在+/-S9条件下检测麦冬水煎剂的致突变性，得到在非抑菌浓度167mg/mL以下对4株标准菌株TA97a、TA98、TA100和TA102全部诱变阴性的结果(资料未发表)。对于麦冬的遗传毒性，尚需进一步研究和探讨。

参考文献

[1]国家食品药品监督管理局.药物非临床研究质量管理规范[S].2003.

[2]InternationalConferenceonHarmonisation，ICHS2B：Astandardbatteryforgenotoxicitytestingofpharmaceuticalsm[S].1997.

[3]《药物遗传毒性研究技术指导原则》课题研究组.药物遗传毒性研究技术指导原则[S].2007.

[4]OECDTG476，InVitroMammalianCellGeneMutationTest[S].1997.

[5]OECDTG474，MammalianErythrocyteMicronucleusTest[S].1997.

[6]谢明.小鼠淋巴瘤细胞基因突变试验方法[J].癌变·畸变·突变，2003，15(3)：183－186.

[7]赵洁，胡燕平，宋捷，等.小鼠淋巴瘤细胞基因突变方法的建立与应用[J].毒理学杂志，2006，20(4)：268－269.