分子遗传学研究方法范文篇1

DNA分子标记技术的研究始于1980年，广泛应用于遗传图谱构建、生物遗传育种、系统学研究、基因定位等方面。主要可分为以分子杂交为基础的分子标记技术，如RFLP、VNTR;以PCR为基础的分子标记技术，如RAPD、SSR;以酶切和PCR为基础的分子标记技术，如AFLP。其中，RFLP是第1代分子标记技术，主要特点是结果稳定可靠，但步骤多，周期长，检出的多态性较少。RAPD属于第2代分子标记技术，操作简单，多态性检出率高，但重复性差。AFLP和SSR属于第3代分子标记技术，它具有以上前2代的优点，是目前应用最多的技术。DNA分子标记技术在蚕豆研究上的应用主要有种质资源鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱构建及重要性状鉴定等几个方面。

1．1蚕豆遗传图谱构建

Vande等［6］在RFLP、RAPD、形态学和同工酶标记的基础上初步构建了一张蚕豆遗传连锁图谱，该图谱包括17个标记分别位于7个连锁群上。Torres等［7］应用RFLP、RAPD、ISZ等方法对64株F2代群体进行了分析，建立了第1张包含11个连锁群的蚕豆遗传图谱。Roman等［8］利用Vf6(感)×Vf136(抗)获得的165个F6RIL单株所构建的图谱中包括277个标记(238个RAPD、5EST、1个SCAR、6个SSR、2个STS、4个同工酶和21个跨内含子标记)，共分为21个连锁群，其中9个位于特定的染色体上，总长度2856．7cm，是目前所公布的蚕豆最饱和的遗传图谱。

1．2蚕豆种质资源分析

利用分子标记技术对蚕豆种质资源进行遗传多样性分析，可为新品种特异性检验和种质资源利用提供重要依据。MahmoudZeid等［9］用AFLP方法对亚洲、北非、欧洲蚕豆进行了遗传多样性研究。W．Link等［10］应用RAPD方法对欧洲和地中海地区的蚕豆种质资源进行了研究。Terzopoulos和Bebeli［11］应用ISSR标记方法对地中海地区蚕豆进行了遗传多样性分析，将该地区的蚕豆分为两大类。Zong等［12～14］利用10对AFLP引物对204份国内冬性蚕豆地方资源和39份国外冬性蚕豆资源进行了遗传多样性分析，通过聚类分析和主成分分析将中国蚕豆资源同国外蚕豆资源明显分开，Polignano等［15］利用草酰乙酸转氨酶、过氧化物歧化酶(SOD)和苹果酸酶(ME)对33份蚕豆资源进行多样性研究，将33份蚕豆资源可以清楚地划分为5个组群。刘玉皎等［16］应用AFLP分析了青海蚕豆种质资源并构建了核心种质。侯万伟等［17，18］构建了青海主栽蚕豆品种的RAPD指纹图谱。

1．3性状基因连锁标记分析

在蚕豆性状标记方面，已开展了与锈病抗性、枯萎病、抗逆性等重要农艺性状紧密连锁的AFLP、RAPD与SCAR标记分析［19］。Roman等［20］利用Vf6(感)×Vf136(抗)杂交获得的139个F2植株首次定位出3个控制蚕豆抗列当的数量性状基因位点，分别为Oc1、Oc2和Oc3，联合表型变异率为74%。Oc1为主效QTL，位于RAPD标记OPJ13686和OPAC02730之间，解释表型变异37．3%，Oc2和Oc3分别解释表型变异11．2%和25．2%。Roman等［21］对蚕豆褐斑病QTL分析发现，控制蚕豆褐斑病的QTL有2个(Af1和Af2)，分别定位到第3和第2号染色体上。Avila等应用RAPD标记方法结合BSA法检测到与蚕豆抗锈病基因连锁的分子标记OPI20900/OPL181032。Diaz等应用RILs群体标记得到与褐斑病连锁的RAPD标记。Ro-man等应用RAPD标记方法研究了蚕豆枯萎病，得到与蚕豆枯萎病连锁的RAPD标记OPA111045/OPAB071026，OPE171272/OPJ18。Arbaoui等应用重组自交系对蚕豆抗寒性进行了研究，初步筛选到与耐寒性相关的遗传标记。Gutierrez等通过研究获得与蚕豆低单宁连锁的SCAR标记SCAD16-B565/SCAD16-H385。以上研究为蚕豆抗病育种及定向育种奠定了分子基础。

2前景及展望

蚕豆组织培养有广泛的应用前景。一是实现蚕豆苗快速、大量繁殖，在蚕豆产业化方面优势明显。二是为科学研究提供实验材料，较传统的田间试验大大节约人力、物力和财力，缩短试验时间，还可以减少环境因子的影响。三是进行基因工程育种。组织培养的成功可以方便地将有用的基因导入需要改良的蚕豆材料中，进而得到具有新功能的蚕豆品种。物种濒危的一个重要因素就是遗传多样性缺乏，利用现代分子标记技术对蚕豆的遗传多样性进行研究，给蚕豆种质收集、保存和保护工作带来很大的方便。

分子遗传学研究方法范文

1对象与方法

1.1对象收集2006年11月-2007年5月就诊于笔者医院胸外科并进行手术的患者127例,其中男性68例,女性59例,年龄(21.23±4.26)岁(16~37岁)。凡一个家系中有≥2例手汗症患者均作为研究对象,共23个高发家系。

1.2方法以手术病例作为先证者,采用自行编制的家系调查表,向先证者本人或其父母详细询问一、二级亲属中手汗症的发病情况,对曾经明确诊断或疑似手汗症的家属逐个面检,其中面检34例,面检率达85%,无法到本院面检的患者由知情者描述病情,然后根据手汗症的诊断标准作出回顾性诊断,绘制家系图[1]。所有调查均由一名胸外科硕士研究生独立完成。

1.3统计学分析采用SPSS11.5软件包分析数据,χ2检验确定有无家族聚集性;应用同胞法和子女总数校正法计算多汗症的分离比,Penrose法估计遗传模式。

2结果

2.1患病率23人先证者中,男性12人(52.17%),年龄(20.17±3.30)岁;女性11人(47.83%),年龄(21.45±5.54)岁。一级亲属、二级亲属的患病情况见表1。先证者一级亲属手汗证的患病率高于二级亲属(χ2=64.61,P<0.001,表1),手汗症的发病率高低与血缘关系的近远显着相关,亲缘关系越近,患病率越高。表1一、二级亲属手汗症患病率

2.2遗传方式计算结果

2.2.1常染色体显性遗传如果手汗症是由常染色体显性基因决定,当本病患者与正常人婚配后,其子女中患者与正常人之比为1∶1,子女如果有患病者,其双亲必定也有患病者。本组23名先证者中,有8名先证者其父母均未患手汗症,故可排除常染色体显性遗传的可能性。

2.2.2常染色体隐性遗传理论上来说,当患者的双亲都是同一隐性遗传病杂合子时,子女中发病患者的数量应该约占1/4,且男女发病机率大致相等。但是在仅分析同胞发病率时,患者的比值往往高于1/4,原因是把后代未患病但双亲都是携带者的家庭未列入在隐性遗传家系的集合群中,造成了系统性误差,所以必须进行校正。由于收集资料的方式不同,校正方法也不同,大体上可分为“完全确知”和“不完全确知”两大类。前者指家庭中所有的患者都已被查证确认,而后者指的是家庭中总有患者不能被查出确认。本调查属“不完全确知”类型,常用的校正方法有同胞法,先证者法、最大似然法、子女总数校正法。笔者采用其中的两种方法进行计算,运算结果见表2。

2.2.2.1同胞法

隐性基因的分离比率p=R-NT-N

标准差=p(1-p)T-N

式中R为所有家庭中有病子女的总数,T为所有家庭中子女总数,N为家庭总数。

根据计算,p=0.2917,标准差=0.0656,95%可信度为(0.1631,0.4203),包含了理论分离比率0.25,说明手汗症属常染色体隐性遗传可能性大。

2.2.2.2子女总数校正法[4]

理论同胞总数=p(1-p)T-N

分离比率=∑R理论同胞总数

式中T为所有家庭中子女总数,N为家庭总数,∑R为患病同胞总数。

根据计算,理论同胞总数为121.44,校正后的分离比率=37/121.44=0.3047。结果与同胞法所得结果相似,说明手汗症属常染色体单基因隐性遗传可能性大。表2同胞数及其患病情况

2.2.3性连锁遗传

2.2.3.1Y连锁伴性遗传若一种遗传性状或遗传基因位于Y染色体上,X染色体上缺少相应的等位基因,因此,这些致病基因随Y染色体的行为而传递,女性中不会出现遗传性状或遗传病,本资料先证者中有47.83%的患者为女性,故没有“传男不传女”的现象,可排除Y连锁伴性遗传。

2.2.3.2X连锁显性遗传若一种显性遗传性状或遗传基因位于X染色体上,在父亲患病、母亲正常的家系中,其所生育的子女中儿子应该全部正常,女儿应该全部患病。本组资料中父亲患病、母亲正常的8个家系中所生育的8个患有手汗症的子女,其中4个是儿子,故可排除这种遗传方式。

2.2.3.3X连锁隐性遗传若一种隐性遗传性状或遗传基因位于X染色体上,当母亲患病、父亲正常的家系中,其所生育的子女中儿子应该全部患病,女儿应该全部正常。本资料中母亲患病、父亲正常的8个家系中所生育的13个患有手汗症的子女,其中8个是女儿,故可排除这种遗传方式。

2.2.4Penrose法估计遗传模式根据同胞患病率(s)和一般人群患病率(q)可以估计某病的遗传方式,依以下标准判断遗传模式:s/q接近1/2q为单基因显性遗传,s/q接近1/4q为单基因隐性遗传病,s/q接近1/q为多基因遗传病。本次调查计算结果:q=0.0037,s=0.2917,s/q=78.838;1/2q=135.135;1/4q=67.568,1/q=16.44。结果显示s/q接近1/4q,进一步证实手汗症为常染色体单基因隐性遗传病可能大。

3讨论

手汗症是一种交感神经功能亢进性疾病,目前已引起遗传病学者的关注。有些学者发现该疾病呈家族性发病,并具有一定的遗传背景,但至今其发病机理尚未完全阐明[23]。本研究采用高发家系调查的方法,收集遗传因子较为相似的“同质”病例进行研究,有助于阐明遗传因素对本病发生的影响。

分子遗传学研究方法范文

南方红豆杉细胞培养及次生代谢研究

红豆杉资源非常有限且紫杉醇含量极低，远远无法满足市场的需求。植物细胞培养具有繁殖速度快，培养条件易于优化，培养过程易于人工控制，不受时间、地域等因素的限制等优点。因此，采用红豆杉细胞培养生产紫杉醇以及对紫杉醇合成代谢途径进行调控来提高紫杉醇的产量已成为当今国内外学者研究的热点课题之一，并已取得了较大进展。对其细胞培养、紫杉醇合成与代谢调控、扩大培养及分离纯化[16-19]等方面开展了广泛深入的研究，研究发现，营养调控[20-23]、物理控制[24-26]、前体饲喂[27]、添加抑制剂[28]、诱导子调控[20-21,29-33]、双液相培养[34]、两步法培养[35]等一系列技术均能影响南方红豆杉的次生代谢。细胞离体培养缩短了培养周期，这样不仅有利于培养条件的优化，也为通过多种诱导途径来提高细胞中次生代谢产物的含量成为可能，南方红豆杉组培体系的不断完善为进一步研究次生代谢产物的合成与代谢奠定了良好基础。细胞培养的最终目的是为了提高紫杉醇的产量，因此利用生物反应器替代摇瓶进行红豆杉细胞规模培养以及工业化生产就成为另一个研究热点和重点。目前，喜马拉雅红豆杉[17]、中国红豆杉[36-37]、欧洲红豆杉[17]、曼地亚红豆杉[38]和云南红豆杉[39]等均实现了生物反应器的大规模培养，部分并已投产[38]。但南方红豆杉细胞悬浮培养尚未实现生物反应器的大规模培养，还正处在研究阶段。另外，近几年来，国内外利用微生物发酵来生产紫杉醇的研究报道也不少，但目前利用内生真菌来产生紫杉醇的产量并不高，尚未能进行工业化。

南方红豆杉分子标记研究

近年来，随着分子生物技术的迅速发展，植物在蛋白质和DNA水平上的遗传多样性研究取得了突破性的进展，并在物种鉴定和濒危物种保护中得到广泛的应用。20世纪90年代以来，分子标记技术被广泛用于动、植物遗传育种、基因诊断、居群遗传学、生物系统学与进化研究上，如RAPD标记技术和ISSR分子标记技术，这2种分子标志均可揭示种间与种内的遗传多样性及其进化的亲缘关系（但后者比前者稳定性和重复性要好），可进一步为开展植物分子辅助育种、遗传转化及其转基因等方面的研究提供有价值的理论依据。2000年，王艇等[40]采用RAPD技术，在分子水平上对南方红豆杉的系统发育进行了探讨。2003年，张宏意等[41]通过随机扩增多态性方法对广东、湖南、江西3省的12个南方红豆杉自然居群进行了基因组DNA多态性分析，分析表明南方红豆杉居群间的遗传距离与这些居群的地理分布相关，相同或相邻产地的居群间的遗传距离较小，不同产地个体间的遗传距离较大。2005年，王贵荣等[42]通过对6个红豆杉种进行RAPD遗传多样性分析和染色体鉴定，得出南方红豆杉与中国红豆杉的遗传距离最小，红豆杉与曼地亚红豆杉的亲缘关系最远，6个红豆杉种染色体数均为2n=24，为进一步保护和利用中国的红豆杉资源提供进化分子遗传学方面的依据。2007年，李振宇[43]根据cpDNA基因间隔区对南方红豆杉的种群遗传结构和系统地理进行了研究，同年，黄丽洁[44]采用叶绿体SSR技术对南方红豆杉的遗传多样性和遗传距离进行了研究，并认为南方红豆杉具有中等水平遗传多样性，不同地区间遗传分化小，种群和地区间基因流较大。2008年，茹文明等[45]通过RAPD技术对南方红豆杉8个自然种群的遗传多样性进行了分析，得出南方红豆杉种群濒危的主要原因不是其遗传多样性，而可能是由其本身生物学和生态学特性及其生存环境破坏所致的。为进一步探讨南方红豆杉濒危原因和对该物种的保护、进化潜力及种质资源利用等方面提供分子遗传学数据。2009年，张蕊等[46]利用ISSR分子标记对来自10省区15个南方红豆杉代表性种源进行了种源遗传多样性及地理变化、种源遗传分化等方面的研究，得出了与上面相一致的结论。同年，张玲玲[47]通过RAPD和ISSR2种分子标记对福建省的南方红豆杉遗传多样性进行了初步研究，并对其RAPD和ISSR2种指纹图谱进行了比较分析。2010年，李乃伟等[48]采用ISSR标记技术对南方红豆杉迁地保护小种群及其衍生自然种群小斑块（小居群）的遗传多样性进行了分析。结果表明，南方红豆杉迁地保护各自然小居群间的遗传距离与其地理生境有关，而与其地理距离并无显著的相关性。2011年，李乃伟等[49]又对南方红豆杉野生种群、迁地保护栽培种群及迁地保护衍生种群的遗传多样性和遗传结构进行ISSR分析和比较，得出南方红豆杉迁地保护衍生种群的遗传多样性与野生种群接近，这为南方红豆杉的物种迁地保护提供了有力依据。