生物多样性的研究方法篇1

关键词海洋生物技术发展展望

近10年来，由于海洋在沿海国家可持续发展中的战略地位日益突出，以及人类对海洋环境特殊性和海洋生物多样性特征的认识不断深入，海洋生物资源多层面的开发利用极大地促进了海洋生物技术研究与应用的迅速发展。1989年首届国际海洋生物技术大会（以下简称mps大会）在日本召开时仅有几十人参加，而1997年第四届imbc大会在意大利召开时参加入数达1000多人。现在imbc会议已成为全球海洋生物技术发展的重要标志，出现了火红的局面。《imbc2000》在澳大利亚刚刚开过，《imbc2003》的筹备工作在日本已经开始，以色列为了举办们《imbc2006》早早作了宣传，并争到了举办权。每3年一届的imbc不仅吸引了众多高水平的专家学者前往展示与交流研究成果，探讨新的研究发展方向，同时也极大地推动了区域海洋生物技术研究的发展进程。在各大洲，先后成立了区域性学术交流组织，如亚太海洋生物技术学会、欧洲海洋生物技术学会和泛美海洋生物技术协会等。各国还组建了一批研究中心，其中比较著名的为美国马里兰大学海洋生物技术中心、加州大学圣地亚哥分校海洋生物技术和环境中心，康州大学海洋生物技术中心，挪威贝尔根大学海洋分子生物学国际研究中心和日本海洋生物技术研究所等。这些学术组织或研究中心不断举办各种专题研讨会或工作组会议研究讨论富有区域特色的海洋生物技术问题。1998年在欧洲海洋生物技术学会、日本海洋生物技术学会和泛美海洋生物技术协会的支持下，原《海洋生物技术杂志》与《分子海洋生物学和生物技术》合刊为《海洋生物技术》学报（以下简称mbt），现在它已成为一份具有权威性的国际刊物。海洋生物技术作为一个新的学科领域已明确被定义为“海洋生命的分子生物学如细胞生物学及其它的技术应用”。

为了适应这种快速发展的形势，美国、日本、澳大利亚等发达国家先后制定了国家发展计划，把海洋生物技术研究确定为21世纪优先发展领域。1996年，

表1近期imbc大会研讨的主要内容

表2近期imbc大会和《marinebiotechnology》学报论文统计表

1.3保证海洋环境可持续利用是海洋生物技术研究应用的另一个重要方面

利用生物技术保护海洋环境、治理污染，使海洋生态系统生物生产过程更加有效是一个相对比较新的应用发展领域，因此，无论是从技术开发，还是产业发展的角度看，它都有巨大的潜力有待挖掘出来。目前已涉及到的研究主要包括生物修复（如生物降解和富集、固定有毒物质技术等）、防生物附着、生态毒理、环境适应和共生等。有关国家把“生物修复”作为海洋生态环境保护及其产业可持续发展的重要生物工程手段，美国和加拿大联合制定了海洋环境生物修复计划，推动该技术的应用与发展。

1.4与海洋生物技术发展有关的海洋政策始终是公众关注的问题

其中海洋生物技术的发展策略、海洋生物技术的专利保护、海洋生物技术对水产养殖发展的重要性、转基因种类的安全性及控制问题、海洋生物技术与生物多样性关系以及海洋环境保护等方面的政策、法规的制定与实施倍受关注。

2.重点发展领域

当前，国际海洋生物技术的重点研究发展领域主要包括如下几个方面：

2.1发育与生殖生物学基础

弄清海洋生物胚胎发育、变态、成熟及繁殖各个环节的生理过程及其分子调控机理，不仅对于阐明海洋生物生长、发育与生殖的分子调控规律具有重要科学意义，而且对于应用生物技术手段，促进某种生物的生长发育及调控其生殖活动，提高水产养殖的质量和产量具有重要应用价值。因此，这方面的研究是近年来海洋生物技术领域的研究重点之一。主要包括：生长激素、生长因子、甲状腺激素受体、促性腺激素、促性腺激素释放激素、生长一催乳激素、渗透压调节激素、生殖抑制因子、卵母细胞最后成熟诱导因子、性别决定因子和性别特异基因等激素和调节因子的基因鉴定、克隆及表达分析，以及鱼类胚胎于细胞培养及定向分化等。

2.2基因组学与基因转移

随着全球性基因组计划尤其是人类基因组计划的实施，各种生物的结构基因组和功能基因组研究成为生命科学的重点研究内容，海洋生物的基因组研究，特别是功能基因组学研究自然成为海洋生物学工作者研究的新热点。目前的研究重点是对有代表性的海洋生物（包括鱼、虾、贝及病原微生物和病毒）基因组进行全序列测定，同时进行特定功能基因，如药物基因、酶基因、激素多肽基因、抗病基因和耐盐基因等的克隆和功能分析。在此基础上，基因转移作为海洋生物遗传改良、培育快速生长和抗逆优良品种的有效技术手段，已成为该领域应用技术研究发展的重点。近几年研究重点集中在目标基因筛选，如抗病基因、胰岛素样生长因子基因及绿色荧光蛋白基因等作为目标基因；大批量、高效转基因方法也是基因转移研究的重点方面，除传统的显微注射法、基因枪法和精子携带法外，目前已发展了逆转录病毒介导法，电穿孔法，转座子介导法及胚胎细胞介导法等。

2.3病原生物学与免疫

随着海洋环境逐渐恶化和海水养殖的规模化发展，病害问题已成为制约世界海水养殖业发展的瓶颈因子之一。开展病原生物（如细菌、病毒等）致病机理、传播途径及其与宿主之间相互作用的研究，是研制有效防治技术的基础；同时，开展海水养殖生物分子免疫学和免疫遗传学的研究，弄清海水鱼、虾、贝类的免疫机制对于培育抗病养殖品种、有效防治养殖病害的发生具有重要意义。因此，病原生物学与免疫已成为当前海洋生物技术的重点研究领域之一，重点是病原微生物致病相关基因、海洋生物抗病相关基因的筛选、克隆，海洋无脊椎动物细胞系的建立、海洋生物免疫机制的探讨、dna疫苗研制等。

2.4生物活性及其产物

海洋生物活性物质的分离与利用是当今海洋生物技术的又一研究热点。现人研究表明，各种海洋生物中都广泛存在独特的化合物，用来保护自己生存于海洋中。来自不同海洋生物的活性物质在生物医学及疾病防治上显示出巨大的应用潜力，如海绵是分离天然药物的重要资源。另外，有一些海洋微生物具有耐高温或低温、耐高压、耐高盐和财低营养的功能，研究开发利用这些具特殊功能的海洋极端生物可能获得陆地上无法得到的新的天然产物，因而，对极端生物研究也成为近年来海洋生物技术研究的重点方面。这一领域的研究重点包括抗肿瘤药物、工业酶及其它特殊用途酶类、极端微生物中特定功能基因的筛选、抗微生物活性物质、抗生殖药物、免疫增强物质、抗氧化剂及产业化生产等。

2.5海洋环境生物技术

该领域的研究重点是海洋生物修复技术的开发与应用。生物修复技术是比生物降解含义更为广泛，又以生物降解为重点的海洋环境生物技术。其方法包括利用活有机体、或其制作产品降解污染物，减少毒性或转化为无毒产品，富集和固定有毒物质（包括重金属等），大尺度的生物修复还包括生态系统中的生态调控等。应用领域包括水产规模化养殖和工厂化养殖、石油污染、重金属污染、城市排污以及海洋其他废物（水）处理等。目前，微生物对环境反应的动力学机制、降解过程的生化机理、生物传感器、海洋微生物之间以及与其它生物之间的共生关系和互利机制，抗附着物质的分离纯化等是该领域的重要研究内容。

3.前沿领域的最新研究进展

3.1发育与生殖调控

应用gih（性腺抑制激素）和gsh（性腺刺激激素）等激素调控甲壳类动物成熟和繁殖的技术[1]，研究了甲状腺激素在金绍生长和发育中的调控作用，发现甲状腺激素受体mrna水平在大脑中最高，在肌肉中最低，而在肝、肾和鳃中表达水平中等，表明甲状腺素受体在成体金银脑中起着重要作用[1]，对海鞘的同源框（homeobox）基因进行了鉴定，分离到30个同源框基因[1]，建立了青鳉的同源框（homeobox）基因[1]，建立了青鳉胚胎干细胞系并通过细胞移植获得了嵌合体青鳉[1]，建立了虹鳟原始生殖细胞培养物并分离出vasa基因[2]，进行斑节对虾生殖抑制激素的分离与鉴定[2]，应用受体介导法筛选gnrh类似物，用于鱼类繁殖[2]，建立了海绵细胞培养技术，用于进行药物筛选[2]，建立了将海胆胚胎作为研究基因表达的模式系统[2]，通过基因转移开展了海胆胚胎工程的研究[2]，研究了人葡糖转移酶和大鼠已糖激酶cdna在虹鳟胚胎中的表达［3］，建立了通过细胞周期蛋白依赖的激酶活性测定海水鱼苗细胞增殖速率的方法[3]，研究了几丁质酶基因在斑节对虾蜕皮过程中的表达［4］，从海参分离出同源框基因，并进行了序列的测定[4]。

3.2功能基因克隆

建立了牙鲆肝脏和脾脏mrna的表达序列标志，从深海一种耐压细菌中分离到压力调节的操纵子，从大西洋鲑分离到雌激素受体和甲状腺素受体基因，从挪威对虾中分离到性腺抑制激素基因[1]；将dna微阵列技术在海绵细胞培养上进行了应用，构建了班节对虾遗传连锁图谱，建立了海洋红藻est，从海星卵母细胞中分离出成熟蛋白酶体的催化亚基，初步表明硬骨头鱼类igf－i原e一肽具有抗肿瘤作用[2]；构建了海洋酵母de—baryomyceshansenii的质粒载体，从鲤鱼血清中分离纯化出蛋白酶抑制剂，从兰蟹血细胞中分离到一种抗菌肽样物质，从红鲍分离到一种肌动蛋白启动子，发现依赖于细胞周期的激酶活性可用作海洋鱼类苗种细胞增殖的标记，克隆和定序了鳗鱼细胞色素p4501acd－na，通过基因转移方法分析了鳗细胞色素p450iai基因的启动子区域，分离和克隆了鳗细胞色素p450iai基因，建立了适宜于沟绍遗传作图的多态性est标记，构建了黄盖鲽est数据库并鉴定出了一些新基因，建立了班节对虾一些组织特异的est标志，从经hiramerhabdovirus病毒感染的牙鲆淋巴细胞est中分离出596个cdna克隆[3]；用pcr方法克隆出一种自体受精雌雄同体鱼类的ß一肌动蛋白基因，从金鲷cdna文库中分离出多肽延伸因子ef－2cdna克隆，在湖鳟基因组中发现了tc1样转座子元件[4]；鉴定和克隆出的基因包括：南美白对虾抗菌肽基因、牡蛎变应原（allergen）基因、大西洋鳗和大西洋鲑抗体基因、虹鳟vasa基因、青鳉p53基因组基因、双鞭毛藻类真核启始因子5a基因、条纹鲈gth（促性腺激素）受体cdna、鲍肌动蛋白基因、蓝细菌丙酮酸激酶基因、鲤鱼视紫红质基因调节系列以及牙鲆溶菌酶基因等［1—4］。

3.3基因转移

分离克隆了大马哈鱼igf基因及其启动子，并构建了大马哈鱼igf（胰岛素样生长因子）基因表达载体[1]。通过核定位信号因子提高了外源基因转移到斑马鱼卵的整合率[1]，建立了快速生长的转基因罗非鱼品系并进行了安全性评价；对转基因罗非鱼进行了三倍体诱导，发现三倍体转基因罗非鱼尽管生长不如转基因二倍体快，但优于未转基因的二倍体鱼，同时，转基因三倍体雌鱼是完全不育的，因而具有推广价值[2]；研究了超声处理促进外源dna与金鲷精子结合的技术方法，将gfp作为细胞和生物中转基因表达的指示剂；表明转基因沟鲶比对照组生长快33％，且转基因鱼逃避敌害的能力较差，因而可以释放到自然界中，而不会对生态环境造成大的危害[3]；应用gfp作为遗传标记研究了斑马鱼转基因的条件优化和表达效率[3]；在抗病基因工程育种方面，构建了海洋生物抗菌肽及溶菌酶基因表达载体并进行了基因转移实验[2]；在转基因研究的种类上，目前已从经济养殖鱼类逐步扩展到养殖虾、贝类及某些观赏鱼类[2.3]。通过基因枪法将外源基因转到虹鳟肌肉中获得了稳定表达[4]。

3.4分子标记技术与遗传多样性

研究了将鱼类基因内含子作为遗传多样性评价指标的可行性，应用sscp和定序的方法研究了大西洋和地中海几种海洋生物的遗传多样性[1]。研究了南美白对虾消化酶基因的多态性[1]；利用寄生性原生动物和有毒甲藻基因组dna的间隔区序列作标记检测环境水体中这些病原生物的污染程度，应用18s和5.8s核糖体rna基因之间的第一个内部间隔区(itc—1)序列作标记进行甲壳类生物种间和种内遗传多样性研究[2]；研究了斑节对虾三个种群的线粒体dna多态性，用pcr技术鉴定了夏威夷gobioid苗的种类特异性。通过测定内含子序列揭示了南美白对虾的种内遗传多样性，采用同功酶、微卫星dna及rapd标记对褐鳟不同种群的遗传变异进行了评价，在平鱼鉴定并分离出12种微卫星dna，在美国加州鱿鱼上发现了高度可变的微卫星dna[3]；弄清了一种深水鱼类（gonostomagracile）线粒体基因组的结构，并发现了硬骨鱼类trna基因重组的首个实例，测定了具有重要商业价值的海水轮虫的卫星dna序列，用rapd技术在大鲮鲆和鳎鱼筛选到微卫星重复片段，从多毛环节动物上分离出高度多态性的微卫星dna，用rapd技术研究了泰国东部泥蟹的遗传多样性[3]；用aflp方法分析了母性遗传物质在雌核发育条纹鲈基因组中的贡献[4]。

3.5dna疫苗及疾病防治

构建了抗鱼类坏死病毒的dna疫苗[1]；开展了虹鳟ihnvdna疫苗构建及防病的研究，表明用编码ihnv糖蛋白基因的dna疫苗免疫虹鳟，诱导了非特异性免疫保护反应，证明dna免疫途径在鱼类上的可行性，从虹鳟细胞系中鉴定出经干扰素可诱导的蛋白激酶[2]；建立了养殖对虾病毒病原检测的elisa试剂盒，用pcr等分子生物学技术鉴定了虾类的病毒性病原，将鱼类的非特异性免疫指标用于海洋环境监控，研究了抗病基因转移提高鲷科鱼类抗病力的可行性，研究了蛤类唾液酸凝集素的抗菌防御反映[2]；研究了一种海洋生物多糖及其衍生物的抗病毒活性[3]；建立了测定牡蛎病原的pcr—elisa方法[3]；研究了latrunculinb毒素在红海绵体内的免疫定位[4]。

3.6生物活性物质

从海藻中分离出新的抗氧化剂[1]，建立了大量生产生物活性化合物的海藻细胞和组织培养技术，建立了通过海绵细胞体外培养制备抗肿瘤化合物的方法[1]；从不同生物（如对虾和细菌）中鉴定分离出抗微生物肽及其基因，从鱼类水解产物中分离出可用作微生物生长底物的活性物质，海洋生物中存在的抗附着活性物质，用血管生成抑制剂作为抗受孕剂，从蟹和虾体内提取免疫激活剂，从海洋藻类和蓝细菌中纯化光细菌致死化合物，海星抽提物在小鼠上表现出批精细胞形成的作用，从海洋植物zosteramarina分离出一种无毒的抗附着活性化合物，从海绵和海鞘抽提物分离出抗肿瘤化合物，开发了珊瑚变态天然诱导剂，从海胆中分离出一种抗氧化的新药，在海洋双鞭毛藻类植物中鉴定出长碳链高度不饱和脂肪酸（c28），表明海洋真菌是分离抗微生物肽等生物活性化合物的理想来源[2]；发现海洋假单胞杆菌的硫酸多糖及其衍生物具有抗病毒活性，从硬壳蛤分离出谷光甘肽一s一转移酶，从鲤血清中分离出丝氨酸蛋白酶抑制剂，从海绵中分离出氨激脯氨酸二肽酶，从一种珊瑚分离出具dna酶样活性的物质，建立了开放式海绵养殖系统，为生物活性物质的大量制备提供了充足的海绵原料[3]；从虾肌水解产物中分离到抗氧化肽物质[4]；从一种海洋细菌中分离纯化出n一乙酸葡糖胺一6一磷酸脱乙酸酶[4]。

3.7生物修复、极端微生物及防附着

研究了转重金属硫蛋白基因藻类对海水环境中重金属的吸附能力，表明明显大于野生藻类[1]，研究了石油降解微生物在修复被石油污染的海水环境上的可疗性及应用潜力[1]；研究了海洋磁细菌在去除和回收海水环境中重金属上的应用潜力[1]；用bacillus清除养鱼场污水中的氮，用分子技术筛选作为海水养殖饵料的微藻，开发了六价铬在生物修复上的应用潜力，分离出耐冷的癸烷降解细菌，研究了海洋环境中多芳香化烃的微生物降解技术[2]；从噬盐细菌分离出渗透压调节基因，并生产了重组ectoine（渗透压调节因子），从2650米的深海分离到一种耐高温的细菌，这种细菌可用来分离耐高温和热稳定的酶，在耐高温的archaea发现了d型氨基酸和无氧氨酸消旋酶，测定了3种海洋火球菌的基因组dna序列，借助于cross／blast分析进行了特定功能基因的筛选，从海底沉积物、海水和北冰洋收集了1000多种噬冷细菌，并从这些细菌中分离到多种冷适应的酶[2]；建立了一种测定藤壶附着诱导物质的简单方法，研究了chlorophyta和共生细菌之间附着所必需的形态上相互作用，研究了珊瑚抗附着物质（dterpene）类似物的抗附着和麻醉作用[3]；分析了海岸环境中污着的起始过程，并对沉积物和附着物的影响进行了检测[4]。

4．展望与建议

生物多样性的研究方法篇2

【关键词】中药化学;研究思路

中药是我国传统防治疾病的武器，中医中药在临床应用了几千年，其疗效经过了实践的检验，并成为世界文化的一朵奇葩。但是由于生产工艺比较落后，质量监控亟待改进，特别是中医独特的哲学思想使西方人难以理解，成为中医药在全世界进一步推广发展的严重障碍。另一方面随着现代科学技术的日新月异和人们对生活与健康水平要求的不断提高，在以科学技术和知识经济为主体的21世纪，要使我国的传统中药以治疗药物的身份堂堂正正地进入国际医药的主流市场，加强中药的基础性研究，加速中药的现代化迫在眉睫。由此国家科技部倡导了“中药现代化科技产业行动”。而中药化学正是中药现代化的基础和前提，如何研究中药化学，是我们每个中药工作者都认真思考的问题。

1中药化学研究现状

近几十年来，中药在化学成分研究方面取得了长足的进展，已对500余种常用中药进行过系统的化学成分研究，发现了近万余种化合物[1]，其中活性成分600余个，大多数为生物碱、黄酮、萜类等低极性的化学成分。从中开发出了40多种一类新药[2]，如青蒿素、人参皂苷Rg3、川楝素等。近年来对极性较大的成分和水溶性成分如皂甙、鞣质、多糖等也进行了研究。但由于缺乏合适的药理筛选模型，加上未能按生物活性导向进行分离，致使绝大多数中药和复方的药效物质基础尚未阐明，因此对单味中药和复方有效成分的研究还未取得真正突破性的进展。

2目前在中药化学的研究中还存在以下几个问题

2.1选题太偏:一部分科研工作者为了避免与他人重复，选择一些极不常见的甚至根本就没有药用价值的植物进行研究，研究成果可能会有新的发现，但大多数毫无价值，至少在医药学上没有价值。中医药是经过几千年实践检验的成果，有疗效的药材才会流传下来，疗效不确切的、无用的药材必然会被淘汰，想从不常用植物中寻找新药，笔者认为是走弯路。

2.2研究目的不明确:中药化学研究的目的是为中医药服务的，而很大一部分中药化学工作者，一味的为研究化学而研究中药化学，以发现新化合物为荣，以发现新化合物的多少来判断科研水平的高低，而不管其是否具有药理活性。

2.3水溶性成分的研究较少:大多数中药在民间常用水煎方式进行口服，然而中药化学工作者较少注意进行水溶性成分的研究。这主要是因为水溶性成分大多是一些高分子成分，难以分离和鉴定结构所造成的。

2.4不注重复方的研究:中药很少以单味药来运用，多以复方形式在临床配伍应用，但是由于科研难度的较大，目前复方药物的研究还是相对比较少见的。

2.5与药理研究相脱节:这一方面有实验经费等客观条件的限制，另一方面也有研究者自身的思想问题，部分中药化学工作者认为找得到找不到化学物质是自己的事，有没有药理活性是药理的事，与己无关。

3如何避免这些问题，笔者认为要注意以下几个方面

3.1要充分注意利用我国丰富的中草药资源以及临床积累的丰富经验。这是我们的一个优势，我们筛选新药要比西方盲目的筛选有针对性。我们参考中医药理论不只是看中药的功能主治，还要看它的煎煮服用方法、配伍应用、采收加工炮制等，这样可以使我们少走许多弯路。如青蒿素的发现就是得益于传统中医药学的典型例子。我国自1967年起筛选治疗疟疾的中草药三千二百多种（包括青蒿，但未成功），均未获满意结果。1969年中国中医研究院中药研究所接受抗疟新药研究的任务，命屠呦呦任课题组长，她以继承发扬祖国医药学为指导思想，从系统收集整理历代医籍本草入手整理出一册以640余种为主的方药集。在此基础上，以鼠疟、猴疟为动物模型，筛选200多个方药，屡经失败，经用现代方法结合古代用药经验，特别结合东晋葛洪《肘后备急方》青蒿“青蒿一把绞汁服，可以治疟”记载，考虑可能有温度、酶解等影响因素问题，反复改进提取方法，终于1971年10月发现青蒿的中性提取物对鼠疟、猴疟有100%的疟原虫抑制作用。经进一步研究分离得到抗疟有效单体，命名为青蒿素[3]。

3.2研究重点要放在中药基础理论的研究上，不要只认准新化合物这条路。对一些中药原理方面的阐述，意义重大。如乌头炮制解毒，何首乌炮制后降低泻下作用等。重视中药基础理论的研究，就是要运用传统理论和现代中药化学研究方法，开展对中药的四气、五味、归经、十八反、十九畏、七情配伍及禁忌等中药理论研究，提示其内在规律和科学基础，从而达到对中药基础理论的科学阐述，最终构建现代中药理论体系。这也是防止中药现代化向中药西药化方向转化的保证。

3.3要与药理研究工作紧密联系。

在现代中药化学的研究过程中，从药材的提取、粗分、细分、纯化到得到单体一直与药理工作相联系，始终对有药理活性的部分，进行深入研究，这样得到活性成分的机率才会增大。否则那些含量甚微又难于分离的活性成分在分离途中极可能丢失，且丢失也难于察觉。与药理工作紧密联系还可以在药材、有效部位和有效成分等不同化学层次进行综合评价，阐明中药的作用机理。

3.4重视民族民间药的研究。研究民族民间药用资源是我国中药的宝库之一，各少数民族积累了不少天然药物用药经验。有些民族在其长期的使用中已形成独特的理论体系，如藏药、蒙药等。民间药物靠代代口述相传，经过了历史的考验。一般来说，民族民间药物，疗效确切，且处方较小，从中发现活性成分或活性部位的机率很高。3.5注重药材中微量成分的研究。随着提取分离及分析技术的不断发展进步，一些过去未知的药材中所含的微量成分被发现，其中不乏具有较强生物活性的成分，如人参和三七中的环肽，可能是一类新型活性成分。

3.6体内活性成分的研究。中药化学成分虽然多种多样，但是当作为口服药物应用时，只有那些能被吸收的成分才是活性成分研究的目标。将药材的水或醇提取物给大鼠服用后，收集血清、尿及胆汁样品，比较投药前后的化学物质差别。随后分离纯化投药之后在血清、尿及胆汁样品中出现的新成分，鉴定它们的结构，探讨它们的活性，确定中药药效物质基础。该方法应用于中药复方的研究，用以明确中药复方以何种形式进入体内，进入体内后如何变化，药物配伍对血中成分的影响，把握中药复方的内在实质。

3.7构效关系的研究构效关系的研究是以活性成分为先导物，合成一系列同类化合物，用适当的药理模型筛选，分析比较活性与无活性分子的构象差异，进行构效关系研究。在本学科中这方面的研究内容很少，基础相对薄弱。近5年来仅有3项相关研究，即对14种新人参皂苷抗吗啡成瘾的构效关系研究、对黄芩的抗焦虑活性成分及其构效关系研究和对广西5种抗癌中草药有效化学成分及构效关系的研究[4]。一些中医药工作者认为，将中药中提取的有效成分进行结构修饰，已经不再是中药。笔者认为，做为一项基础研究，探讨中药活性成分的作用机理，构效关系的研究是非常必要的。如何研究，如何保持中医药的特色而不备西药化，还需进一步的探讨。

3.8加强对复方药物的研究。中药复方研究是采用现代科学技术方法阐明中药方剂治疗作用的物质基础及作用原理，对阐明中医药理论、将中药方剂推向国际社会具有重要的意义。对中药复方治疗作用的物质基础及作用原理依然所知甚少，中药复方研究尚未走出一条中医药独特的道路。

3.8.1中药复方研究目前存在的问题主要是：①目前中药复方物质基础研究还过多地集中在寻找与单一药效作用相关的单体成分，对复方多成分共存状态下的化学——药效相关性的系统研究并未得到足够的重视，中药质量标准的控制上也多采用测定其中某一单一成分。②中药复方的实验药理学研究虽然逐年增加，但绝大多数也仅限于药效学的观察，而且由于没有中药化学工作者的有效配合，方剂组成多不稳定，药效重现性较差，难以准确反映复方的药理学作用。

3.8.2对中药复方研究的总体思路是：①将中药复方作为一个整体进行研究。中药复方配伍后的化学成分并非是单味药化学成分的简单加和，复方在煎煮过程中有化学成分含量及种类的变化，如：柴胡和赤芍配伍后，既有成分的增溶现象，又有成分的减弱现象，同时还有新峰产生[5]。显然，将单味化学成分提纯，在配伍的方法，不能反应中药复方的特色。②采用多指标活性评价体系。中药复方采用多途径、多靶点、整合调节机制发挥药效作用。中药作用的多样性给活性成分研究带来了机遇的同时，也带来了困难。因此在追踪分离活性成分过程中，像西方那样只用单一活性筛选体系追踪分离得到的活性物质很难合理说明中药的真正作用物质基础。应采用多指标活性评价体系，以便尽快追踪分离得到目标活性成分。③在目标活性成分为等剂量条件下进行目标活性成分、单一药材及复方的药效学对比，探讨复方的组方依据及作用原理。④标准处方和标准汤剂的研究，用现代药理学手段确认标准汤剂的药效。中药复方多水煎服用，按照制定的标准工艺做成标准汤剂，采用现代药理学研究方法正确表达与确认标准汤剂或其冻干粉的临床疗效。此项工作是整个中药研究的前提。⑤采用全成分综合分析的方法。对中药化学成分的研究不能脱离中医药理论，中药用药讲究整体，是多组分协同作用。对复方的研究中药复方由多味药材组成，每种药材均含有很多化学成分，这些成分尽管其中一些已被提取、分离和鉴定，但仍有很多是未知的化合物。因而对中药复方除了进行“有效成分”的研究外，还应从全成分综合分析的方法去认识其作用的化学物质基础。该法也同样适用于单味药的研究。

综上所述，中药化学要想取得突破性的进展，还任重道远，需要我们每一位药学工作者共同的努力，进行多学科合作，结合中医药理论，引进现代科学技术和方法，进行长期深入持续性研究，根深叶茂，厚积薄发，为中药现代化奠定坚实的基础。

参考文献

[1]果德安．浅谈中药现代化过程中的几个关键问题[J]．中草药，2003，34：9～11

[2]刘建利．中草药活性成分的结构修饰与新药研发[J]．中草药，2003，34：73～77

[3]杨光华，饶淑华．青蒿素发明发现的方法学研究[J]．医学与哲学，1997，18（12）；641～644

生物多样性的研究方法篇3

中药新药研究具有系统性、阶段性和复杂性的特点,其研究涉及药学、药效毒理、临床等多方面的内容。每一方面的研究内容都包含大量的试验,通过这些研究获得科学的试验证据,以了解和确认药品的安全性、有效性和质量可控性。对研究用样品进行良好的质量控制,用质量均一的样品进行研究是正确认识药品安全性、有效性、质量可控性的前提,也有利于对试验过程中出现的问题进行分析。笔者拟对目前中药新药药理毒理研究用样品在质量控制方面的注意事项进行初步分析和讨论,供同行参考。

1中药新药研究用样品进行质量控制的必要性

中药新药研究的系统性要求对研究用样品进行良好的质量控制。新药研究需要多学科协同,运用不同方法,从不同角度对相同的对象进行研究。如果中药新药的药效、毒理等研究中使用了不同批次的样品,则可能因样品的质量差异较大,而难以准确判断药品的安全性和有效性。特别是当新药研究的不同试验分别由不同单位承担时,尤其需要关注研究用样品质量的均一性,并进行严格的质量控制。

中药新药研究的阶段性要求对研究用样品进行良好的质量控制。在新药研究的不同阶段,药材、工艺及稳定性等研究的成熟程度不同,样品的质量也有一定的差异。故需要将研究用样品的质量波动控制在一定的范围内,才能保证不同阶段研究结果之间的衔接。一般而言,药理毒理研究用样品、临床试验用样品,以及大生产样品的质量应基本一致,这样才能使临床前研究结果为临床试验提供可靠的参考,使临床试验准确反映上市后产品的有效性及基本的安全性信息。尤其当新药研究的时间跨度较大时,需要关注不同研究阶段所用样品质量的均一性。

中药新药成分的复杂性要求对研究用样品进行良好的质量控制。由于中药新药所含成分相对复杂,大多数中药复方制剂的有效成分、毒性成分都不十分明确,且影响中药质量的因素较多,需要从原辅料、制备工艺、质量检验、贮存条件、包装等多方面进行全过程的控制,才能保证中药新药研究用不同批次产品质量的相对一致,保证研究结果准确、可靠,并经得起重复。

2药效毒理研究用样品的质量控制

中药药效毒理研究用样品的形式一般有药材粉末、浸膏(包括经调节ph或渗透压、除鞣质、加表面活性剂、增稠剂等处理后的浸膏)、有效成分及有效部位、制剂、含药血清等,应根据研究需要制备符合相应要求的样品。

2.1样品的制备

一般应在处方、工艺等基本确定后,在中试以上规模制备样品。以浸膏等中间体的形式给药时,可采用中试规模的中间体为样品。

2.1.1药材粉末

往往需要加一定量的水,将药粉混匀后以混悬液的形式给药。此时需关注药粉混悬的均匀度,特别是当处方中含矿物药或不同药材粉末的相对密度相差较大时,需避免不同相对密度药材粉末分布不均匀的现象,每次吸取混悬液时应充分混匀；必要时可添加助悬剂,并充分搅拌,但需说明其种类、用量及加入方式等。

2.1.2浸膏

在进行药效毒理研究时,往往需要设立多个不同给药剂量组,一般可通过改变浸膏中所含生药量(浓度)或给药容量来解决。应说明样品的完整制备过程,避免不同批次样品在制备过程中可能的质量差异。如提取物浓缩或干燥的方法或条件(温度、压力、受热时间等)不同,对样品中所含成分可能产生不同的影响。研究过程中,如给予试验动物染菌的样品,可能引起动物的炎性反应等,影响试验结果。可根据情况对浸膏进行必要的灭菌处理,以保证卫生学符合要求,应详细说明灭菌的方法和条件,并尽量与制剂的灭菌方法和条件相近,避免灭菌条件过于剧烈而破坏药物的成分。

2.1.2.1整体试验用浸膏

①水溶性浸膏：浓度合适的可直接给药。当样品为相对密度较大的浸膏或干浸膏时,为方便给药和剂量的准确分配,往往需要加水稀释,此时需说明为保证样品的均匀性而采取的措施,如搅拌的方式和条件等。②脂溶性浸膏：可采用多种方式使药物成分均匀分散,以便于给药,如加入适量表面活性剂增溶后给药；或加入高分子材料并采用固体分散技术制成固体分散体,分散后给药；或将干浸膏分散于水中,加入增稠剂并搅拌制成均匀的混悬液后给药等。浸膏的这些处理可能会改变药物的吸收利用情况,从而对样品的安全性及有效性产生影响,需慎重选择样品的处理方式,并进行相应的研究。

2.1.2.2离体试验用浸膏

此类试验包括离体组织器官、细胞及分子水平试验等,所用样品往往需要进行预处理,如调节渗透压及ph值,离心或过滤,排除鞣质或金属离子等杂质的干扰等。需尽可能在模拟人体内环境下进行试验,并进行细胞毒或其他干扰试验。此时,应关注向样品中加入的ph及渗透压调节剂等的种类及用量,样品处理的方法和条件等。

2.1.3有效成分及有效部位

一般可用适当溶媒溶解或混悬后给药,难溶性药物可采用与难溶性浸膏相同的方法处理；特殊制剂需以完整的制剂形式给药。

2.1.4制剂

在制剂对药物的吸收利用影响较大或给药途径特殊的情况下,应以制剂的形式给药,如缓控释制剂、注射剂、肠溶制剂、外用制剂等。为适应不同给药剂量的需要,固体制剂可通过调整辅料用量制成含生药量不同的规格；液体制剂通过调整溶媒量制成含药浓度不同的规格；皮肤给药的外用制剂可制成面积不同或含药物量不同的规格等。毒理研究中为充分暴露药物的毒性,应尽可能提高制剂中药物的含量(或浓度),如注射剂可专门制备含药量较高的规格(提高药物含量,降低辅料用量,并保持渗透压平衡)；外用制剂也可通过提高制剂的含药量、增大与皮肤接触的有效面积等方法充分暴露毒性。

一般应以中试以上规模的样品作为供试品,特殊情况下也可以在较小的规模下(仅指制剂成型部分)制备供试样品。如因人用制剂的规格较大,不便于给药,可制成供小鼠用的小胶囊等专用规格进行研究；但缓控释制剂、注射剂等制剂的成型工艺应在中试以上规模进行,以避免制剂工艺的差异对药物成分及其吸收利用产生影响。肠溶制剂可用肠溶胶囊、肠溶片等形式直接给药。缓控释制剂应在不破坏制剂的情况下给药,避免对制剂的控释膜、制剂形态等的损伤。

2.1.5含药血清

需明确制备含药血清的详细方法,如动物的情况(动物品系、等级、性别、体重、健康状况等)、样品情况、给药剂量、给药周期(包括每日给药次数、连续给药天数等)、取血方式和时间、血清灭活及保存的方法及条件等。

2.2样品的检验

以浸膏或其他中间体为试验供试品的,应参照制剂的质量标准进行检验,并推算指标成分的含量、限量检查等是否符合要求；以不同规格制剂为供试样品的,同样可参照制剂质量标准进行检验,并按规格进行折算。为较好控制浸膏等样品的质量,应根据需要建立有针对性的质控指标和方法,并明确质控要求,如应对浸膏的相对密度、微生物限度等进行控制。

2.3样品的稳定性

以制剂形式给药的,可参考制剂稳定性研究结果确定合适的有效期及贮存条件,并在制剂的有效期内进行试验。

以浸膏形式给药的,需要研究在所用包装下浸膏的有效期及贮存条件(相关稳定性研究资料应附在相应试验资料后)。如应保证长期毒性研究用浸膏在试验期间的质量稳定,避免因长期存放在不合适条件下对样品质量的影响。可向浸膏中加入适量防腐剂,但应关注其种类及用量是否符合要求,是否影响其生物活性。应明确样品的使用要求,如密封于玻璃瓶或药用塑料瓶中的浸膏,开封后如不能一次用完,需在低温下密闭保存,并在规定的时间内使用。必要时应选择合适的装量规格,使浸膏在开封后的较短时间内用完。浸膏给药的,还应采用符合药用要求的包装材料包装,并在包装上标明品名、批号、贮存条件及有效期等。

3常见问题

新药的药效毒理研究中,与样品有关的常见问题有：①研究过程中,对处方、工艺等进行过多次调整,但未采用处方及工艺最终确定后生产的样品为研究对象进行药效毒理研究,而采用中间过程样品的研究数据替代；或者生产规模较小,在中试以下规模制备样品,其质量与临床试验用样品相差较大,难以为临床试验提供可靠的参考。②申请注册的资料中,研究样品的背景不明确,如所用药材的产地、基原及质量状况不明；样品的批号、制备工艺参数,以及所用原辅料等情况不明；样品中所含药材量不明,难以准确分析不同试验结果之间的关联等。

4建议

生物多样性的研究方法篇4

代谢组学研究的是生物体系受到内在和外在因素刺激产生的内源性代谢变化，可以对那些能描述代谢循环情况的关键化合物进行定性和定量分析。近几年来，代谢组学已经成为生命科学领域一个重要的、有价值的工具，并在不断创新的分析技术推动下稳步发展。虽然代谢组学本身还存在一些不足，但许多研究者以解决问题为出发点，提出了一些新的研究策略、方法和技术。代谢组学发展呈现出整合一体化，定量化和标准化的趋势。本文对代谢组学的概况，现在的发展情况和未来的趋势进行综述。【关键词】代谢组学研究策略分析方法综述

1代谢组学的概况

代谢组学(metabonomics)是以组群指标分析为基础,以高通量检测和数据处理为手段,以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支，是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后系统生物学的另一重要研究领域,它是研究生物体系受外部刺激所产生的所有代谢产物变化的科学，所关注的是代谢循环中分子量小于1000的小分子代谢物的变化,反映的是外界刺激或遗传修饰的细胞或组织的代谢应答变化[1]。代谢组学的概念最早来源于代谢轮廓分析[2]。nicholson研究小组于1999年提出了代谢组学的概念[1],并在疾病诊断、药物筛选等方面做了大量的卓有成效的工作[3～5]。fiehn等[6]提出了metabolomics的概念,第一次把代谢产物和生物基因的功能联系起来,之后很多植物化学家开展了植物代谢组学的研究,使得代谢组学得到了极大的充实,同时也形成了当前代谢组学的两大主流领域:metabolomics和metabonomics。经过不断发展，fiehn[6,7]、allen[8]、nielsen[9],villasboas[10,11]等确定了代谢组学一些相关层次的定义，已被学术界广泛接受。第一个层次为靶标分析，目标是定量分析一个靶蛋白的底物和/或产物；第二个层次为代谢轮廓分析，采用针对性的分析技术,对特定代谢过程中的结构或性质相关的预设代谢物系列进行定量测定；第三个层次为代谢指纹/足印，定性并半定量分析细胞外/细胞内全部代谢物；第四个层次为代谢组学，定量分析一个生物系统全部代谢物，但目前还难以实现。

作为应用驱动的新兴科学,代谢组学已在药物毒性和机理研究[12，13]、微生物和植物研究[14]、疾病诊断和动物模型[15，16]、基因功能的阐明[17]等领域获得了较广泛地应用。近来,代谢组学又在中药成分的安全性评价[18]、药物代谢的分析[19]、毒性基因组学[20]、营养基因组[21]、药理代谢组学[22～24]、整合药物代谢和系统毒理学[25,26]等研究方面取得了新的突破和进展。

完整的代谢组学分析的流程包括样品的制备、数据的采集和数据的分析及解释。样品的制备包括样品的提取、预处理和化合物的分离。代谢物通常用水或有机溶剂(甲醇、己烷等)提取。分析之前,常先用固相微萃取、固相萃取、亲和色谱等方法进行预处理，用气相色谱、液相色谱、毛细管电泳等方法进行化合物的分离。预处理后,样品中的代谢产物需要通过合适的方法进行测定。色谱、质谱、磁共振、红外光谱、库仑分析、紫外吸收、荧光散射、放射性检测、光散射等分离分析手段及其组合都在代谢组学的研究中得到应用。其中,核磁共振（nmr）技术特别是氢谱以其对含氢代谢产物的普适性,色谱以其高分离度、高通量，质谱（ms）以其普适性、高灵敏性和特异性而成为最主要的分析工具。代谢组学研究的后期需借助于生物信息学平台进行数据的分析和解释[27],解读数据中蕴藏的生物学意义。最常用的是主成分分析（pca）法和偏最小二乘（pls）法。

但在研究的几个步骤中，代谢组学还存在一些不足。例如，分析手段存在局限性；全部定量分析难以实现，准确性不足；定性过程复杂。针对这些问题，现在的研究者们在研究策略和方法上做着积极的探索和改进。本文就将综述近年来在代谢组学研究策略和方法上的最新的研究报道，并结合本实验室的研究进行展望。

2研究策略与方法

后基因组时代众多组学的发展向分析化学提出了更高、更严峻的挑战。对代谢组学，一些关键点的把握显得尤为重要。首先，代谢组学的整体分析平台的提升是未来代谢组学研究的关键环节，这包括：新的复杂样品预处理技术；灵敏、专一、原位、动态、无损、快速的代谢物组检测、表征与操纵技术；代谢物组成、结构和功能信息获取的新型技术和完整的数据采集和成像系统；有效、快速处理代谢组海量复杂数据的新化学信息学方法以及这些技术和方法学的原始性创新、学科间交叉和多维技术联用基本理论研究等。再者，制定代谢组学标准(包括方法、信息和数据库)，以及实现代谢组与基因组、转录组和蛋白质组等数据的整合，是未来代谢组学研究的一个关键问题。针对这些关键点，代谢组学的研究策略和方法得到了新的发展。

2.1整合一体化

由于现有的分析技术都有各自的优缺点[28],单独使用一种或少数几种已经很难满足代谢组学研究的要求。所以整合的策略已经成为一个重要的趋势，这个整合不仅包括各种技术、方法，还包括不同来源的生物样品（血液、尿液、粪便等）。可以将目前的整合策略归纳为以下几个方面。

2.1.1分析技术的整合这个整合包括了不同分离技术、不同的数据获取方式、不同数据分析技术等。这样可以达到分析平台优势互补，使结果更完善、准确。在这方面刘昌孝等[29～31]做了一些液相色谱和质谱联用技术与化学计量学方法结合，应用于代谢组学的研究工作，并对这方面的发展进行了综述。chen等[32]也利用了整合的思想，提出了一套完整的潜在代谢标志物从发现到定性再到生理意义说明的方法。他们将指纹谱分析、多变量分析、液相串联质谱（lcms/ms）、微制备、傅立叶离子回旋共振质谱（fticrms）、气相质谱（gcms）、数据库检索、同位素标记物比对等方法进行了整合，利用整合后的平台对糖尿病进行代谢组学分析。先用uplcms采集数据，经数据处理后寻找到潜在生物标志物，经过微制备后，再利用fticrms和gcms进行分析，得到精确分子量和气相保留指数，再结合碎片分析，通过查询数据库最终确定标志物的组成及结构。再通过同位素标记物的比对，最终明确此化合物并进行了生理意义的说明。这个方法适用于所有进行代谢组学研究的体系，能使标志物的鉴定更为可靠和令人信服，为潜在标志物的寻找提供了一套标准有效的操作流程。还有人研究了多种离子化方式对代谢组学研究结果的影响[33]，发现单用电喷雾离子源（esi）的负离子模式比正负离子模式相结合少了90%的离子量，结合大气压化学电离（apci）后，离子量多了20%，而结合esi、apci、基质辅助激光解析电离（maldi）和多孔硅表面解吸离子化（dios）后，离子量提高了一倍，这在一定程度上代表信息量的增加。此外，亲和液相色谱、反相液相色谱和气相色谱的整合[34，35]、nmr与ms的整合[35]、不同填料色谱柱（如：c8、c18、苯基柱）的整合研究[36]都有报道。对于无商品化和不易得到标准品的物质,lee等[37]在定性分析中使用了绝对淌度和酸解离常数进行辅助解析，这也是整合思想的一个体现。这些研究都表明，整合策略正是现在代谢组学研究策略发展的一个重要方向。

在数据分析技术上，也体现着整合的思想。由于代谢组学分析产生的是信息量丰富的多维数据,因此，需要充分整合化学计量学和多元统计分析方法等技术，对代谢组学数据进行分析说明[38]。目前在代谢组学中运用较多的包括主成分分析、层次聚类分析(hca)、非线性影射(nlm)等非监督分类方法,以及偏最小二乘法判别分析（plsda)、k最近邻法(knn)、神经网络(nn)等监督分类方法。每一种方法都有各自特点，通过比较、整合可以得到更完整的结果。

2.1.2数据的整合由于样品分析手段的多样性，产生了许多不同的代谢组学数据，这需要通过数学统计方法对不同数据加以整合,crockford等[39]在进行毒理学研究时，采用了shy（statisticalheterospectroscopy）方法对nmr与ms数据进行了整合，为生物标志物的发现提供了一个系统生物学工具。另外，lcms数据和gcms数据的融合[40]等也有报道。关于数据的另外一个整合是指代谢组学数据与其它一些整体研究数据之间的整合。随着现代自然科学技术不断发展，各种基于整体的研究，如蛋白组学、代谢组学、基因组学等不断出现并相互交叉，通过整合整体研究数据[41～43]，可以更全面和深刻地阐明生物网络复杂性，准确理解代谢物与蛋白质、代谢物与基因之间的关系。廖沛球等[44]就在用代谢组学方法对硝酸钕急性生物效应进行研究时，将大鼠血清中一些重要的生化指标及组织切片光镜图分析结果与代谢组学数据结合讨论。从数据形式上,采用xml通用标记语言的质谱数据可同时适用于蛋白质组和代谢组,同时,在细胞信号通路等领域有重要作用的系统生物学标记语言sbml也正发展成xml形式[45]；有些研究也采用sysbioom数据记录平台,将pedro形式的蛋白质组数据和代谢组数据整合至mageom模式的转录组数据中[46]。组学数据整合可以通过代谢网络支架(scaffold)分析、建模方法或借用有关专业软件来实现[47]。yang等[48]利用代谢组学与蛋白组学技术，并将两者相结合来研究dna免疫调节对脂代谢的影响。在毒理分析中，spicker等[49]就用一个分级模型整合了临床化学数据，基因蛋白表达数据和其他的一些数据。由此看来，对于许多复杂的体系，单一内容的数据已经很难准确反映出体系的性质和变化，这就需要更加重视采用多种数据来共同研究问题、解释问题。这样得出的结果更全面、更准确。

2.1.3研究对象的整合通过整合代谢组学(integratedmetabonomics)方法，同时对机体中不同来源的生物样品(尿样、血样、组织样等)进行代谢组学分析、数据比较和综合评价，可以使代谢组学的结果更完整、更准确[50]。nicholson实验组[51]将血样、尿样和肝脏组织样品分别进行代谢组学研究，将研究结果整合来进行毒理研究，得到了更好的研究结果。saric等[52]进行了粪便代谢组学研究，研究揭示了粪便代谢组群的种类变化与肠胃功能的关系。一些研究者还对大鼠毛发进行代谢组学分析[34]，表明毛发在寻找生物标志物上也有重要作用。

2．2定量化

从代谢组学的各个层次的定义不难看出，定量是人们追求的一个较高的目标。lee等[53]在研究壬基苯酚毒性作用时，就对比了有目标定量研究（针对雌激素、雄激素、肾上腺皮质激素）和无目标代谢指纹谱分析的结果，他们发现无目标、无准确定量的代谢组学研究结果只揭示毒性作用与作用量有关系。而有了准确定量后，毒性作用还表现出了与作用时间的相关性。代谢组学一直朝着全面定量努力。wang等[54]在代谢组学研究中就十分注重量的概念，在神经管畸形的研究中，他们根据先验知识锁定了一碳代谢循环通路，定量了11种物质，同时，也对同一样品进行代谢指纹谱分析，将定量结果加入到指纹谱结果中进行问题的说明。在糖尿病肾病研究中，整合了磷脂类、脂肪酸类、氨基酸类、核苷类和激素类五大代谢循环轮廓谱，定量了百余种物质，将这些再与指纹谱结合，将使代谢组学的研究更全面，更可信，有可能更清晰地去研究疾病的机理，达到疾病预警，指导并评价治疗的目的。

随着重视程度的增加，许多新的定量策略和方法都被提出并得到实验验证。对于定量，内标的使用是一个重要的手段，上文提到的毒性研究实验就是采用雌二醇d4为内标来定量。另外，bajad等[55]在用lcms/ms分析时，同时使用非同位素内标和同位素内标来实现定量，共定量了141种化合物，其中包含了氨基酸和核苷酸代谢的许多相关物质。可以说，内标的使用不但可以进行数据校准，还可以辅助定量。最近，weljie等[56]提出一种用于nmr进行代谢组学研究的定量方法，叫做靶标轮廓法，他们利用许多种纯品的光谱数据建模，从而建立一个数据库，通过检索比对来鉴定并定量代谢物，这个方法解决了低浓度物质和重叠区物质的定性定量问题。同位素比率的方法用于代谢组学定量是一种较新的尝试，huang等[57]在使用二维气相飞行时间质谱进行分析时，用d6标记的mtbstfa作为衍生化试剂对分析物进行衍生化，再根据同位素比率对分析物进行定量。通过对各种定量新方法的比较，可以看出，使用内标进行定量的方法会有鉴定方便，定量准确的优点，比较适用于那些结构非常清楚，内标物比较易得的物质的定量，而建模型数据库进行检索比对的方法的优点是比较简便，成本较低，但准确性有所欠缺。在实际研究中，应该根据每个研究对象的不同特点进行选择。

2．3标准化

由于代谢组学分析技术和操作条件的多样化，使得大量产生的数据和结果缺乏规范性,这给代谢组学数据的采集、存储、查询、比较、共享和整合等带来诸多不便。这就需要研究者对一整套的过程进行标准化。首先，在生物样品的收集、灭活和储存上，大多研究者就已经按照一些标准化程序来做。其次，在样品的前处理上，alzweiri等[58]系统地比较了乙腈、丙酮、甲醇和乙醇的除血样中蛋白和尿中的盐效果，为建立标准化前处理方法提供一些依据。在样品分析上，内标的使用就在一个更小层次的标准化上起到了一定作用。目前，最主要的标准化还是针对于数据的处理。代谢组数据的标准化也开始尝试类似转录组学和蛋白质组学的方法[59]，具体地规定有关实验和分析方法的数据格式和必要信息。如bino等[60]提出了miamet的代谢物组学数据模式，涉及实验设计、样品收集、处理和分析等各环节；基于miamet，jenkins等[61]提出了更为细致和完整的基于gcms的植物代谢物组学数据标准armet；kell等[62]采用xml标记语言,可将信息标准扩展到包括应用nmr和ms等技术的代谢组学数据中。代谢组数据的标准化工作需要科研、企业及政府机构等多方面力量共同参与。在这方面，倡导者之一的smrs工作组发挥了重要作用[63]，该小组已制订和了有关代谢组分析方法的标准化报告的详细草案[64]。

2．4新的分析方法

2.4.1样品预处理样品预处理是代谢组学研究中的重要内容[65,66]。基于代谢组分析的系统性，整个样品处理和分析过程应尽可能保留和体现样品中完整的代谢物组分信息,所以样品的预处理就显得尤为重要。许多研究工作也聚焦在了新的预处理方法上。webbrobertson等[67]在尿液预处理时，加入叠氮化钠，来防止细菌污染；在气相色谱质谱研究中，相转移催化技术(ptc)可以使分析物与离子对试剂形成离子对，利用它在有机相中溶解性好的特点，提高衍生化效率[68]。kind等[69]在尿液与处理上，采用尿素酶分解了尿中含量很高的尿素，与不进行此预处理的尿液相比，这种方法使一些被掩盖的信息表现出来。

2.4.2样品分析现阶段，样品分析和数据采集主要采用nmr和ms两种方法。其中，nmr技术，特别是新发展的高分辨魔角旋转、活体磁共振波谱和磁共振成像等技术使nmr成了代谢组学研究领域最主要的分析技术之一[70]；而现代ms技术也以其高灵敏度和专属性的优势而在代谢组学研究中备受青睐。一些应用于代谢组学研究的新技术也出现在这些相关领域中。超高效液相色谱/高分辨飞行时间质谱(uplc/tofms)技术及联机的markerlynx自动化数据处理软件早已运用到了研究中，为代谢组学研究提供了从样品分析到数据分析全过程的整体解决方案[71]。fticrms具有超高分辨率和准确度,可以配备大气压电离(apci)、纳升级电喷雾(nanoesi)和maldi等各种离子源,在代谢组学研究，尤其是未知物确定上发挥了很大的作用[72～74]；在代谢指纹的快速扫描中,直接输注质谱法的应用日趋广泛[75,76]；电喷雾解吸电离(desi)的质谱技术(ambientms)[77～79]基于多孔硅表面的解吸离子化技术(dios)，突出特点是在常压下能将表面吸附的分析物进行解吸电离，这样就避免了样品预处理和基质背景干扰，从而实现ms对复杂样品进行原位、高通量、非破坏的分析，获得更直接和全面的样品信息[80]。wang等[81]自主研发了一套全自动亲水色谱柱/反相色谱柱加和转换的液质联用体系，从而将极性大的化合物进行了更细致分离，扩大了信息量，有助于全面准确衡量代谢情况。这套体系适合用于任何复杂生物样本的分析中，能简单而有效地完成极性范围很宽的不同物质的分离分析。enke等[82]在飞行时间质谱（tofms）的基础上发展了一套新分析技术，称为飞行距离质谱（dofms），它的分辨率可与四极杆和离子阱相媲美，而且还保持了tofms的优点，并提高了信噪比和动态学应用范围。在气相研究中，研究者创新地使用了纤维填充毛细管柱[68]，它的耐高温性能扩展了气相色谱的使用范围。

2.4.3数据分析数据处理的一些新的方法开发和应用，有力地推动了代谢组学的发展。saude等[83]根据不同代谢物和内标物的不同纵向弛豫率，得到校正因子，对代谢物的定量结果进行校正，大大提高了定量准确率；yang等[84]发展了一种峰校准算法，他们先定义了一系列响应比较强的峰，将保留时间划分为几个区间，对各个区间进行校准，并在肝病代谢组学研究中得到应用。oh等[85]开发了一个新的信息处理软件包，可以在样品数据中寻找同种代谢物产生的峰，并能消除杂峰（如污染物的峰），他们还用混合标准品和血样加标验证了软件准确性。在以gcms进行植物实验分类学研究中，splot作为一个能反映出代谢物与分类模型之间的共方差和相关性的工具，被用于鉴别有统计学意义和生理学意义的代谢物[86]。还有svd在线性最小二乘基础上的使用，能在一定程度上削弱峰重叠对峰指认和定量的影响[87]；mzmine和xcms能对保留时间进行校准[69]。这些方法的目的都是尽量减小分析中产生的误差，使结果更准确。

3展望

目前，国内外许多研究者都在进行代谢组学研究，代谢组学应用的范围和领域也在不断扩大。但这些研究依然存在了许多问题亟待解决。（1）在代谢全谱分析中缺乏量的概念。在这个问题上，我们通过这几年对代谢组学进行的研究，也提出了自己的一些策略和思想，首先是将代谢指纹谱与定量进行了结合，称之为定量代谢指纹谱技术。这个结合包含了两个层次，一个是数据采集技术上的结合；一个是数据分析技术上的结合。这样的结合能实现指纹谱与定量优势互补，将更清晰、更全面、更准确地反映研究对象的代谢情况。（2）虽然代谢组学强调无歧视分析，但对于任何一个体系，都按代谢组学常规步骤按部就班地进行分析，往往最终都没有得到有用的结果。针对这个问题，我们认为要重视先验知识的重要性，了解哪些代谢循环、代谢物质最可能与研究体系相关，利用这样的先验知识指导代谢组学分离分析条件的优化、潜在生物标志物的鉴定，将大大提高代谢组学研究的效率，并能很好地避免研究重心偏离的情况。（3）生物标志物的寻找单一而片面。特别是对于疾病的研究，以前不太重视代谢、蛋白、基因数据与临床数据的结合，各个方面的研究者就在自己的研究数据中进行挖掘，以此来寻找标志物，探寻机理。但实践证明，这样得出的结果都会有片面性，缺乏说服力。在这个问题上，应该强调代谢组学数据与其它数据的结合，特别是临床相关数据，以此来发现包含了不同数据内容的复合生物标志物，这也是今后代谢组学发展的一个重要方面，同时，这也为生物代谢或临床表型多样性研究[88]提供更可靠的方法和工具。

尽管存在许多的问题，但也看到了在研究策略上整合一体化、标准化、定量化的趋势，并且看到了在问题导向下的新技术的不断涌现，这都将推动代谢组学不断持续发展。相信随着关注度的提高、人力和物力的不断投入及应用范围的不断扩大，代谢组学必将得到更为稳健的发展。

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85ohc,huangx,regnierfe,buckc,zhangx.j.chromatogra,2008,1179:205～215

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生物多样性的研究方法篇5

关键词：生物资产资产评估评估方法

一、生物资产价值评估的背景

生物是人类赖以生存和经济、社会持续稳定发展的物质基础。地球上多种多样的植物、动物和微生物为人类提供了不可缺少的食物、纤维、木材、药物、工业原料和服务。与此同时，由于人类社会的不断进步，科技的不断发展，对生物资产的需求也越来越多。而且，由于生物资产本身的一些特性，其在人的劳动与自然力的共同作用下生长的，受自然规律和自然环境的影响，另外每种生物资产的生长、发育、成熟、结果都不同，因此，对生物资产的研究不管是从会计角度还是评估角度都是比较重要的。从会计角度看，全球范围内不管是组织、协会还是个人已经认识到生物资产的确认与计量问题，在这方面研究最早的是澳大利亚会计准则委员会(AustralianAc―countingStandardsBoard，简称AASB)于1998年颁布的1037号(AAS35)会计准则，即自生和再生资产(self-GeneratingandRegener-atingAssets简称SGARAs)会计准则，《国际会计准则第41号――农业》(以下简称IAS41)对生物资产的研究从概念的界定、初始确认到后续计量作了详细具体的介绍。我国在借鉴国外会计准则的基础上，2006年颁布《企业会计准则第5号――生物资产》。

但从资产评估的行业讲，对生物资产的价值评估的研究很少。目前具体的生物资产的价值评估准则，这给从事生物资产的企业的经济活动带来了不便，制约了其快速发展。而且也不能很好地向信息使用者传递一些有用可靠的信息，影响了信息使用者的决策。为了保证会计与评估的相互协调与合作，进一步体现评估对会计的补充和完善作用。在当前市场经济不断深入的大潮中，生物资产的租赁、重组、典当、保险、交换等经济行为的不断增多，不能仅依据生物资产的账面价值来反映，还要借助于生物资产价值评估的相关理论与方法，以资产评估结果重新确定其价值。

二、生物资产价值评估的意义

随着经济的快速发展，涉及生物资产的企业与日俱增，探讨生物资产价值的评估问题，对评估行业和企业都有一定的理论意义与现实意义。从理论上讲，首先，为生物资产价值评估做出理论贡献。通过借鉴其他国家对其他行业，尤其是农业资产评估和森林资源资产评估的价值评估理论，可以得出生物资产价值评估的目的、依据和方法。在评估范围越来越细、越来越广的情况下，可以为进一步研究资产评估理论体系和评估方法、模型提供参考，对于推动资产评估理论的发展有重要意义。其次，可以推动会计学相关理论在该领域的应用。从实践上讲，有利于建立全行业统一的评估准则，使评估机构能够很好的按照规范行事，使生物资产的评估更加明朗化；有利于持有生物资产的企业更好地掌握本企业的资产价值情况，促进企业加快生产，提高企业资产价值；有利于不同地区企业持有的生物资产的价值在一定程度上具有可比性；有利于生物资产的信息使用者获得全面、详实、可靠的评估信息；有利于进一步推动和完善评估准则，加快我国评估领域的发展；有利于以财务报告为目的的生物资产价值评估的发展；有利于协调有关评估各方的经济利益。

三、西方国家生物资产价值评估的现状分析

英国《评估指南》(红皮书)1996版指南12――森林与林地资源评估，提到了关于资源类植物价值评估的一些方法。《欧洲资产评估准则》(EVS)2000版指南5

贷款为目的的农业资产评估中将农业资产划分三个大部分来说明：第一部分介绍农业资产包含的内容以及相互之间的区别、评估方法以及市场价值的确定；第二部分介绍了多年生植物的存在形式――正在生长着的、培育中的、收获的和其他形式的，还介绍了一些牲畜；第三部分主要介绍了在评价这些动植物时影响因素和多年生植物的评估方法。《IVS指南10――业资产评估》2005版该指南中指出了生物资产是活的动物和植物，评估中将其划分为附着地的生物资产和非附着地的生物资产，将其区别于农业资产和个人财产进行评估，要求根据农业生物资产的类型和周期性按照市场法对农业资产进行评估。《澳大利亚评估准则与实践》对乡村资产评估进行了介绍，其中包括对生物资产相关不动产的阐述，如果园的建设投资、养殖设备、设施等评估。国外学者进行很多有关生物多样性经济价值评估的理论、方法及其应用的研究，从生物多样性经济价值的类型、评估方法和案例研究等方面进行论述，国外比较流行的是条件价值法。20世纪70年代以后，随着福利经济学对消费者剩余、机会成本、非市场化商品与环境等公共产品价值的思考，生物多样性经济价值的评估研究逐步形成了一套较为完整的理论、方法体系。经济合作与发展组织(简称经合组织，OECD)将评估方法分为三类，即实际市场价格法(市场分析)、模拟市场法和替代市场法。

从上述国外研究现状来看，虽然国际评估准则和发达国家的评估准则中对农业资产评估的研究有许多可取之处，但相对于其他资产评估研究来讲，起步较晚，而且也不成熟。各评估准则中只是粗略介绍影响生物资产的自然因素，都没有详细说明生物资产具体的评估依据、评估原则和不同生长阶段下的评估方法及一些参数的选取，未将其作为重点进行研究.、随着社会的进步及评估的范围的不断扩大，现有的国外的理论与方法不能满足生物资产发展的需要。

四、我国生物资产价值评估的现状分析

我国的资产评估行业是改革开放和建设社会主义经济的过程中逐渐发展起来的，属于新兴行业。1989年，原国家国有资产管理局下发了《关于国有资产产权变动必须进行资产评估的若干规定》，这是我国首次提及资产评估问题的政府文件。1993年中国资产评估协会成立，随着社会主义市场经济的发展，资产评估项目越来越多、规模越来越大，涉及行业越来越广，技术复杂程度也越来越高。1996年颁布了《森林资源资产评估规范(试行)》，2001年又颁布《资产评估准则――无形资产》具体准则。但目前关于生物资产价值评估的文献很少，而且部分都是从森林资源或者森林生物多样性角度进行的，尚未对生物资产有较全面和系统的研究。本文从生物资产概念、森林资源价值评估、森林生物多样性经济价值评估、作物种质资源价值评估和果园资产评估等方面进行说明。

(一)生物资产的概念2006年以前，一些专家学者们借鉴IAS、《澳大利亚自生和再生资产会计准则》和其他国家的会计准则，对生物资产的界定还没有统一的认识，2006年的《企业会计准则第5号――生物资产》，给出了生物资产的定义：生物资产指有生命的动物和植物。并将其划分为消耗性生物资产、生产性生物资产和公益性生物资产。为了研究方便可将生物资产划分不同种类：按其生物学特性分为动物和植物；按其生长周期长短分为一年生生物和多年生生物；按价值转移方式的小同，分为消耗性生物资产和生产

性生物资产；还可划分为成熟生物资产和未成熟生物资产(何梦圆、马慧，2006)。

另外，我国学者在会计核算基础上总结出生物资产和其他资产相比，具有下列基本特性：一是生物资产形成的特殊性。一般资产完全是依靠人们的生产劳动取得的，而生物资产是通过人的劳动和生物自身的生长、发育过程相互作用形成的。生物资产的价值形成除凝结有人类劳动以外，自然力作用的生长、发育会形成其增值；生物资产的经营受自然规律的制约，遵循自然规律，生物资产就会顺利地生长、发育，不断再生，反之则会消亡，失去其价值。二是生物资产的多样性。生物资产的种类繁多，这使其各自的生长、发育特点差异很大，增加了计价难度。三是生物资产经营周期的既定性。生物资产的投人、生产、经营、回收的周期完全决定于生物的生命周期，不同于工业生产周期以及资产价值转化的周期可人为控制。生物资产的这些特点决定了生物资产会计处理的特殊性和复杂性。

(二)资源类价值评估资源类的价值评估主要包括以下方面：

(1)森林资源价值评估。我国资产评估协会尚未制定有关生物资产价值评估的相关规定，1996由原国家国有资产管理局和林业部制定《森林资源资产评估规范(试行)》(以下简称《规范》)，以适应我国森林资源资产评估事业的发展，规范森林资源资产评估工作，保护森林资源资产所有者、经营者和使用者的合法权益。依据《中华人民共和国森林法》、《国有资产评估管理办法》和《林业部、国有资产评估管理局的通知》等有关文件制定的，具体规定了森林资源资产的评估程序和基本方法，对林木资产评估、林地资产评估、森林景观资产评估及整体林业企事业资产评估作了详细规定，规范了森林资源资产评估行为。按照大范围森林资源包含的经济林也属于生物资产的范畴，此《规范》中指出了森林资源中林木、林地、森林景观及整体林业企事业的评估程序和评估方法。

侯元兆等(2005)第一次比较全面地评估了中国森林资源价值，核算出了生态服务价值，即涵养水源、防风固沙和净化大气的经济价值三项生态服务价值，首次得出了森林的这三项环境价值远大于立木价值的结论.并在此基础上进一步完善了森林资源价值核算的理论。王强(2006)按照森林资源资产的特殊性，以及影响森林资源资产价值因素的复杂性，详尽的介绍了各类森林资源资产的具体评估方法，包括市场成交价比较法、市场价倒算法、年净收益现值法、年金资本化法、收获现值法、重置成本法、序列工数法、历史成本调整法，重点介绍了运用收益现值法时应考虑的折现率问题和质量调整系数。该项研究中还按照不同种类介绍了各评估方法的应用，其中林木资产评估中从用材林、经济林、竹林、防护林和特护林方面，详细介绍了评估方法的应用及评估时涉及的影响因素。何梦圆、马慧(2006)研究指出，按照生物资产的特征，消耗性生物资产采用重置成本法和市场倒摊法进行评估，生产性生物资产按照生长阶段确定评估方法。邹继昌(2006)采用收益现值法对用材林林木资产进行评估，给出了评估参数及评估公式，说明了采用收益现值法的理论依据。谢德新(2006)提出了经济林按照生长阶段产前期、始产期、盛产期和衰产期进行评估，指出成本法主要适合于产前期，市场法理论上适合于任何长阶段，但现阶段因前提条件不具备限制了这一方法在经济林资产评估实践中的实际应用。经济林的收益年限在整个经济林寿命中所占比重最大，故经济林的资产评估主要以收益法为主。

(2)森林生物多样性经济价值评估。北京大学教授张颖开创性地利用市场价格法、机会成本法和支付意愿法，对我国森林生物多样性的价值进行核算，得出了我国森林生物多样性价值的成果。吴火和(2006)研究认为，针对森林生物多样性资产的不同价值需要采用不同的计量评估方法，主要采用市场价格法、替代市场法和模拟市场法(假想市场法)。为提高评估的效率和评估结果的准确性与可信度，在综述了国内外生物多样性信息系统研究和应用进展的基础上，尝试设计了基于专家知识的智能型森林生物多样性资产价值评估专家辅助系统(ESEFBA)。而且文献还列举了龙栖山自然保护区森林生物多样性生物资产类价值评估，从木材生产价值评估和林副产品生产价值评估角度对直接实物资源资产进行评估，其中林副产品采用的是市场价值法。李银霞(2002)以祁连山自然保护区为例，从直接使用价值评估方法和间接使用经济价值评估方法两方面对森林生物多样性经济价值评估进行论述。

(3)作物种质资源价值评估。作物种质资源又称作物遗传资源，是生物多样性的重要组成部分。朱彩梅(2006)在对作物种质资源的价值概念、价值属性、价值特点、价值分类、价值内涵以及价值评估方法系统研究的基础上，系统地探讨了作物种质资源的价值构成分类及其评价方法，提出了作物种质资源价值评估的原则和依据。其中涉及资产评估基本方法――市场法的应用。

(4)果园资产评估。应容枢(1998)在对果园调查研究基础上，根据果园的特征、经营果园面临的行业风险和涉及到的果园时间价值补偿因素，得出果园应采用重置成本法和收益现值法。

从以上对国内的生物资产价值评估研究现状的分析可以看到，对于生物资产的概念界定问题从会计上已基本达成共识。由于研究问题的方式、方法的不同，对生物资产的分类还是还存在争论。我国目前还没有完整的农业资产评估准则，就生物资产的角度，对植物经济价值的评估的文献还是较多的，具体有经济林及林副产品，但没有涉及到其它植物，如蔬菜、经济作物、粮食作物的评估方法及影响因素。并且对动物的评估理论与方法的研究较少。

生物多样性的研究方法篇6

关键词：变性梯度凝胶电泳；微生物实验；实验教学改革

中图分类号：G462文献标志码：A文章编号：1674-9324（2013）39-0247-02

微生物学是高等院校生物类专业的一门重要专业基础课，是一门实验性和应用性很强的学科。微生物学实验是微生物学的重要组成部分，是现代生物学技术的重要基础，对于学生加深理论知识的理解，培养创新与实践能力具有非常重要的作用[1]。传统的微生物实验教学内容一般以验证性和演示性为主，注重培养学生的基本实验技能，但对学生综合实验技能和创新能力的培养有待提高。随着国家对创新人才的需求，适当增加综合性和研究性实验内容的比重是微生物实验教学改革的发展方向，对于提高学生的思维能力、动手能力有着积极的作用[1-3]。

本校非常重视实验教学改革工作，鼓励学生在掌握基本实验技能后，积极参加设计性、研究性实验，包括院校两级的大学生科研立项或教师的研究课题，并给予相应的创新学分。通过该项措施进一步激发了学生的学习兴趣，并有效提高了学生的实验技能及分析问题和解决问题的能力。目前微生物实验教学主要包括传统的微生物实验技术，随着分子生物技术的发展，微生物研究技术突破了以往主要依赖纯培养物的局限性，特别是在生态环境样品中的微生物群落结构分析中，基于PCR扩增的分子生物学方法逐渐取代了传统的培养方法，大大拓展了微生物研究的范围[4]。因此，我们在后续的研究性实验中引入了变性梯度凝胶电泳在微生物群落结构分析中的应用等创新型实验项目，使实验教学从基础性向综合性和研究性推进。

一、变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术概述

由于自然环境中微生物生存条件的复杂性，大多数微生物以未可培养的形式存在。DGGE是一种不依赖微生物培养技术的研究方法，能快速、准确鉴定环境中微生物种群，在揭示复杂微生物群落演替规律和功能基因多样性方面具有独特的优越性，已被广泛应用于微生物分子生态学研究各领域[5]。DGGE技术的基本原理是在聚丙烯酰胺凝胶的基础上，加入呈梯度分布的变性剂（甲酰胺及尿素），双链DNA分子部分解链导致电泳迁移率降低，而序列不同的DNA分子解链行为不同，在凝胶中的移动速度也就不同，从而使得长度相同而序列不同的DN段分离。因此，通过测序分析凝胶上不同的谱带，可以检测微生物种群的遗传多样性和动态变化[6]。DGGE技术的工作流程主要包括以下几个步骤：（1）环境样品的采集；（2）样品中微生物基因组DNA的提取；（3）DN段的PCR扩增；（4）PCR产物的DGGE分析；（5）DNA条带的序列分析。

二、变性梯度凝胶电泳技术在微生物实验教学中的应用

变性梯度凝胶电泳技术是一项综合性较强的实验技术，涉及的知识面较广，要求学生既要有全面扎实的理论知识，又要求较强的实际动手能力。我校的微生物学实验安排在大学二年级的上学期，通过学习使学生掌握微生物学实验的基本原理和操作技术。此外通过后续的生化分析技术和分子生物学实验等课程，学生掌握了聚丙烯酰胺凝胶电泳、基因组提取和PCR扩增等实验技术。因此该项研究性实验项目主要面向大学二年级和三年级的学生，我们为学生提供开放的实验室环境，学生自己组成实验小组，可根据自己的实际情况安排时间。整个实验由学生实验小组开展并完成，同时在实施过程中配备指导教师进行随时指导。根据学生的学习兴趣并结合实验室的科研课题，我们近几年开设了多项DGGE技术在微生物研究中应用的实验，包括《氯嘧磺隆对土壤微生物类群的影响》、《SBR反应器中聚磷菌群的结构分析》、《不同森林土壤中产漆酶细菌群落结构的研究》和《厌氧污泥对偶氮废水的脱色及污泥菌群结构分析》等研究性实验项目。环境样品中DNA的提取是影响微生物多样性的DGGE检测结果的重要因素[7]，学生通过比较不同提取方法对DNA产量和纯度的影响，确定了针对不同的实验样品（土壤或污泥）的最佳提取方法，在这一过程中加深了对DNA提取原理和方法的认识。通过DGGE图谱的分析，学生可以直观地了解到污染胁迫等环境条件下微生物群落结构的改变及优势菌群形成的动态过程，更加深刻地理解富集培养技术在分离特定功能微生物上的应用。学生通过后续的序列比对分析，可以学习到相关环境中常见的微生物优势菌属，特别是一些非培养微生物序列的出现丰富了学生对微生物多样性的认识。通常面向本科生开设的微生物实验主要以好氧微生物为对象，因此学生接受的微生物学知识侧重于好氧微生物，对厌氧微生物的接触和认识较少。我们通过引入厌氧环境中微生物结构分析等实验项目，使学生有机会接触厌氧箱的使用，掌握厌氧微生物的培养方法等实验内容，进一步丰富实验教学内容，深化实验教学改革。

三、小结

分子生物学技术的发展，展示了一个更为丰富的微生物世界。与目前基于高通量测序的微生物多样性分析方法相比，DGGE技术具有快捷、方便、成本低等优点，适合应用于微生物创新实验教学。通过这些研究性实验的开展，使学生完成无法在正常教学时间进行的实验内容，拓展了与其他学科实验技术的综合应用，在激发学生学习兴趣的同时，不仅提升了学生的实验操作技能和团队协作能力，而且增强了综合思考及分析解决问题的能力，为独立完成毕业论文实验及今后从事科研工作打下了坚实的基础[8]。

参考文献：

[1]张萍华，蒋冬花.微生物学创新实验教学体系的构建与实践[J].微生物学杂志，2013，32（3）：107-109.

[2]袁生，徐旭士，戴传超，何伟，张茵，尚广东，戴亦军.微生物学实验课程的改革与实践[J].高等理科教育，2012，（2）：138-140.

[3]贾艳萍，张兰河，马姣.立足学科发展的微生物学实验教学改革研究[J].实验技术与管理，2012，29（12）：26-32.

[4]李晓然，吕毅，宫路路，柳陈坚.微生物分子生态学发展历史及研究现状[J].中国微生态学杂志，2012，24（4）：366-369.

[5]李琬，李景鹏.分子生物学技术在堆肥微生态研究中的应用研究进展[J].中国农学通报，2012，28（18）：20-25.

[6]王洋清，杨红军，李勇.DGGE技术在森林土壤微生物多样性研究中的应用[J].生物技术通报，2011，（5）：75-79.

[7]高慧琴，刘凌.PCR-DGGE技术中不同DNA提取方法综述[J].安徽农业科学，2011，39（1）：52，102.

[8]高健，周建良，蒋本桂，张洁.普通微生物实验教学全面开放理论的建构[J].当代教育理论与实践，2012，4（3）：113-114.