干细胞培养技术范文

关键词：细胞培养室；建设与管理；配套设备；管理制度

Constructionandadministrationofnationalengineeringlaboratoryforcellculture

MengXiangyu，GuTiejun，ZhaoXinghong，SunBo，ShiYuhua，ZhangXizhen

JilinUniversity，Changchun，130012，China

Abstract：Exploredtheconstruction，corollaryequipment，function，commonmanagement，administrationsystemofnationalengineeringlaboratoryforcellculture，andtheestablishmentofcellbank.Wearemakingeffecttodevelopthefunctionofcell-cultruelaboratory，andimprovethemanagementoflab，whichleadingtohigherstudyrequirementandfullnecessaryassurancesfornationalengineeringlaboratory.

Keywords：cell-culturelaboratory；constructionandadministration；corollaryequipment；administrationsystem

细胞培养室是吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验室的重要组成部分，细胞培养是生命科学研究领域的一种最基本、最重要、应用最广泛的研究技术之一[1，2]。对于疫苗国家工程实验室而言，建立一个设施完善、配套齐全的综合性的细胞培养室至关重要，加强细胞培养室的日常管理，建立健全细胞培养室的管理制度，建立完备的细胞种子库，是保证工程实验室其他各项科研工作顺利开展的不可或缺的重要一环[3-5]。笔者综合在国家工程实验室中细胞培养室的建设与管理过程中积累的实践经验，介绍细胞培养室的设计、筹建及其服务职能与管理等方面的工作。

1细胞培养室的设计与建设

1.1细胞培养室的面积要求及位置选择

由于艾滋病疫苗国家工程实验室多数科研课题涉及细胞实验，进行细胞实验操作的人员众多；产学研相结合的工程实验室特色也要求细胞培养室不论从规模上还是从功能上都要满足从科研到产业化的过度[6，7]，在设计过程中还要充分考虑细胞实验所需的配套设备的安装和使用，满足细胞培养室的环境设计要求和方便管理。因而，需要在工程实验室内选择一个相对独立并有足够面积的空间，来建设细胞培养室。

1.2细胞培养室环境要求及洁净级别

由于细胞操作的洁净度要求高，细胞培养室整个框架为洁净级彩钢板结构，环氧自流平地面，无卫生死角。细胞培养室设有内走廊，封装走廊与外相通的门窗，将细胞室与外面的实验室隔离开来，成为一个相对独立的区域，并配有高效过滤系统及臭氧发生器，使细胞室整个环境空间保持万级洁净要求；内顶棚安装紫外灯，定期照射，为内环境消毒；为满足细胞培养室的温、湿度要求，配备了专业净化级别的通风与空调系统；培养室入口处为三重缓冲设计，第一道入口处放置专用鞋柜，进入细胞室的操作人员需统一换上细胞室专用的拖鞋，进入第二道门需更换专用的白大衣，通过风淋室进入缓冲走廊去往不同的细胞操作间。

1.3独立细胞操作间的设计

为满足不同课题、不同细胞株的培养要求，在细胞培养室的内走廊设有8个独立的细胞操作间，每个操作间内配备最基本的细胞培养与操作的仪器设施，如全钢实验台、洁净工作台、CO2孵箱、电动移液器及微量移液器等，房间内也安装高效过滤器与紫外线灯，满足房间的无菌要求，并可定期对操作间进行单独的消毒处理。

1.4细胞培养室专用仪器间的设计

由于进入细胞培养室做实验的人员众多，空间有限，一些公用的设备无法达到每个细胞操作间独立配置一套的要求，因此为满足整个细胞室的需求并方便所有细胞室人员的使用，在8个操作间相对中间的位置，建造了一个独立的公共仪器间，配有专用的台式离心机、倒置显微镜、细胞计数仪、水浴锅等常规仪器，并配置了数台4℃冰箱及-20℃冰柜，满足细胞操作者储存细胞培养液和其他试剂之需。

1.5洗刷间与高压间的设计

相比于同类实验室，国家工程实验室存在规模大、人员多、细胞培养量大的特点，完全使用一次性细胞培养耗材会大大提高科研成本，造成一定程度的浪费，给国家工程实验室的可持续发展带来一定的困难。因此，大量细胞培养最好使用可洗刷灭菌的玻璃培养瓶等可重复使用的耗材，为此，我们在与入口相对应的另一端设计了专门的洗刷间和高压间，配备了专门的洗刷设备，湿热、干热等灭菌设备和专门的制水设备。这种设计是基于细胞室环境要求的净污分流的原则[8]，由双扉高压灭菌柜和干热灭菌柜将细胞培养区与洗刷准备区隔离开来，并配有传递窗来实现人流与物流的分离[9]。我们还配备了专门的工作人员负责非一次性细胞培养瓶及移液管等物品的清洗及高压灭菌工作，满足细胞室洗刷、高压及配液等要求，既避免了一次性耗材使用的浪费，又减轻了科研人员的负担。

2细胞培养室的服务理念

细胞培养室建设的宗旨是服务工程实验。为细胞培养室配备专门的工作人员和管理人员负责日常管理和服务，可以大大减轻科研人员的负担。细胞培养实验对操作人员的要求，除要掌握熟练的操作技术外，更要掌握复杂的培养技术及严格的无菌要求。研究人员需要较长时间才能熟练掌握操作技术，如果每天都被清洗、包装和消毒等简单却烦琐的工作困扰，将会影响科研人员的效率，也使其不能专心致志地从事研究活动[2]。因此，建立大型的综合细胞培养室，并配备专门的管理人员，可以提高细胞培养的效率，加快科研进程。由于人员众多，技术熟练程度参差不齐，需要对进入细胞室的人员进行规范化管理，定期举行技术培训。这样，会对提高细胞操作人员的基本实验技能，帮助他们养成良好的实验习惯，减少事故的发生，杜绝浪费，提高细胞实验的效率起到不可估量的作用。

3细胞培养室的管理

3.1人员的管理

进入细胞培养室做实验的人员，都须经过管理人员的批准，并进行相应的技术与安全培训，包括细胞室设备的使用、细胞培养技术服务和安全管理制度等，经考核合格后，到管理人员处领取专门的拖鞋及工作服，到指定的细胞操作间进行实验操作。实验人员在细胞培养室工作期间，需听从管理人员的安排，承担本操作间及相应的细胞培养室公共区域的值日。为加强对细胞培养室人员的管理，逐渐实行管理网络化[10]，建立QQ群或微信群，在网络上进行入室申请、入室登记等管理，相互提醒细胞培养室使用注意事项，相互交流细胞培养及细胞培养室使用过程中经常出现的问题以及解决办法等。

3.2细胞培养室管理制度的建立

3.2.1卫生清洁制度

（1）每个进入细胞室的工作人员应保证个人卫生[11]，必须洗手并用酒精消毒。（2）进入缓冲间时，应按照分配的编号更换洁净的工作服和拖鞋，并将自己换下来的鞋放入指定的鞋架上。进入细胞操作间时须戴帽子和口罩，进出细胞培养室要随手关门。（3）第一个进入细胞培养室的人员应及时打开空调及空气净化装置，最后离开的人员负责关闭空调及空气净化装置。（4）整个细胞室每周进行一次卫生消毒工作，每月进行一次全面的清洁工作。

3.2.2CO2培养箱的使用

（1）每天观察CO2压力表，如发现CO2气体量不足，及时更换钢瓶，同时观察CO2钢瓶上的流量指示表，空瓶上应贴标签以示区别。培养箱内应放置温度计，观察并记录其温度与指示表温度是否一致。（2）培养箱内应划分不同使用区域，不同细胞应放在不同的隔板层，每天观察底部水盘，及时更换或添加，保持适当的湿度。（3）细胞室内所有CO2培养箱均具有高温消毒功能，非管理人员未经允许不能动此功能键，以免造成某些元件损坏[8]。

3.2.3超净工作台的使用

（1）使用超净台前应提前30分钟用紫外线照射灭菌。（2）超净台内的物品摆放整齐，便于操作。（3）注意安全，特别是酒精灯，如有酒精漏出应立即吸干擦净，如发生意外可用湿纱布、棉布类盖灭酒精灯。（4）实验结束后及时倒掉废液缸内的液体，需洗刷的物品应冲洗后交给洗刷人员，暂时不用的液体封好瓶口后及时放回相应的冰箱层，同时进行台面清洁。

3.2.4液氮罐和低温冰箱的管理

（1）管理人员需定期检查液氮罐内的液氮情况，并做好记录，发现液氮不足及时订购补充。（2）往液氮罐内转移冻存细胞及取用细胞时，应注意防冻安全。（3）存放细胞株时，根据细胞种类的不同，放置在不同的分隔盒内，同时标记好细胞株的名称、冻存人员姓名与冻存时间。（4）低温冰箱使用时应按其种类划分不同区域，做好标记并记录。

3.2.5仪器间的管理

仪器间内所有仪器由管理人员统一安排定期清洁与保养，使用完毕应及时关闭电源，并严格按照仪器标准操作规程使用，由于操作不当造成的仪器损坏按照损坏程度与金额给予责任人一定程度的经济处罚。

4细胞种子库的建立

工程实验室由于科研项目众多，涉及课题内容广泛，因而细胞实验所涉及的细胞种类繁多，需要相应的足够数量的细胞储备才能满足科研课题对各类细胞的需求。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候再复苏细胞用于实验。适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞种子丢失，起到细胞保种的作用[12]。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞株[12]。经过几年的积累，细胞培养室技术人员已经建立起了完备的细胞种子库，冻存细胞株百余种，并建立了完备的细胞电子档案，对细胞名称、种属、来源、库存数量、冻存时间、存放位置及其适宜的培养条件等进行了详尽的记录，对实验室自建的细胞株与从外面采购来的细胞株做明确的区分和标记；科研人员与学生复苏细胞要有严格的计划，提出申请，做好复苏记录，并定期跟踪细胞种子库存情况，及时对库存不足的细胞给予必要的补充。

5结束语

随着生命科学的飞速发展，建设一个大型综合性的细胞实验室，适应疫苗国家工程实验室的科研需求，建立健全完善的细胞室管理制度，建立完备的细胞种子库，可以促进工程实验室科研水平的提升，为加快科研进程提供必要的保证，对工程实验室的可持续发展有着重要的现实意义。

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干细胞培养技术范文

[关键词]骨髓基质干细胞；成骨细胞；诱导分化

中图分类号：R681文献标识码：B文章编号：2055-5200（2014）02-035-04

前言

骨髓基质干细胞作为干细胞的一种，具自我更新和多分化潜能，具备成为种子细胞[1-2]的可能，在组织工程发展的热潮中引起科学工作者关注，但围绕骨髓干细胞的相关研究尚处于起步阶段[3-4]。胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）可以通过跨膜的酪氨酸蛋白激酶受体RET激活细胞内多巴胺（DA）神经信号，从而促进神经细胞存活和分化过程。aDA-2006是本实验者在实验中筛选、发现的一种易透过细胞膜、无细胞毒作用、可人工合成的小分子化合物。本实验具体分析DA-2006促进骨髓基质干细胞分化为成骨细胞的机制，为骨组织工程的临床应用提供一定依据。

1材料与方法

1.1实验材料

实验动物：选择南京青龙山的3周龄新西兰大白兔（雄性）。实验试剂与相关仪器：Trizol（美国Invertrogen公司），SYBRGreen（日本Toyobo株式会社），反转录试剂盒（日本Toyobo株式会社），0.25%胰酶（上海生物工程有限公司）、新生牛血清（维森特生物技术有限公司）、细胞孵育箱（赛默飞世尔科技中国有限公司）、超净工作台（浙江安泰医药有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1培养方法脱颈处死大白兔，在75%酒精中浸泡25-35min后，在兔胫骨结节0.5-1cm处分别抽取骨髓1.5mL，同时加入等体积的DMEM培养液，将液体移至50mL离心管中，1400rpm/min转速离心5-10min，吸去上清及脂肪层，然后在离心管中添加10%FBS的DMEM培养液4mL，进行颠倒混匀20次，按1×106个细胞/cm2的密度，将细胞接种于10cm细胞培养皿中，置于饱和湿度孵箱（37℃、5%CO2）中培养。经48h细胞培养后，换液50%，去除未贴壁细胞、红细胞等，以后每72h进行一次换液。原代培养9-12d后细胞达80%融合，采用添加0.02%的EDTA的0.25%胰蛋白酶进行消化后传代[2]。

将第2代细胞分3组进行培养，诱导组A采用诱导培养液[4]（普通培养液中添加108mol/L地塞米松，0.01mol/Lβ-甘油磷酸钠，50mg/L维生素C），诱导组B采用含1?LMDA-2006的普通培养液。对照组采用普通培养液。

1.2.2检测方法（1）PCR检测标志基因的表达：取传至第3代BMSCs细胞，吸弃培养液，添加1mL冰浴PBS，利用移液器反复轻微吹打细胞，致细胞脱落，1000rpm/min离心细胞收取，转至1.7mL离心管，加入1mLTrizol溶液，加入0.2mL氯仿。Vortex混匀，5min室温静置，然后11000rmp离心，时间为15min。将上层的水相转入到1.5mLEP管，添加等体积异丙醇，Vortex混匀，然后放于-20℃冰箱中，过30min后，11000rmp离心，10min。小心把上清倒掉，保留沉淀。添加1mL75%的乙醇，然后洗涤RNA沉淀，最后7000rmp离心6min。弃上清，静置5min。

NanoDrop定量后按照TOYOBO的RT-PCR试剂盒说明书进行。应用PrimerPremier5.0的软件设计、合成ALP、OC、OPN基因引物（上海博尚生物技术有限公司），其特异性利用融解曲线进行分析验证。

cDNA表达丰度采用Ct值进行检测，β-actin的Ct值作为内参。

反转录结束之后，利用SYBRGreen（Toyobo）按说明书进行荧光定量PCR。

3步法进行Q-PCR扩增，反应条件如下表1。

表1Q-PCR扩增条件

温度（°C）时间（S）循环次数

95101

921545

602045

723545

（2）MTT法测生长率：各组细胞，经胰酶消化后，进行计数，以2.5*103/L接种于24孔板中，每一孔添加250?L，3组均处于37℃、5%CO2条件下进行培养，在检测前，每孔加入4mg/mLMTT25L，继续培养3h，吸弃培养液，每孔添加150?LDMSO，振荡10min，利用酶联免疫检测仪，在490nm波长进行检测各孔吸光光度值，每日检测3孔，进行均值计算。

观察不同组别不同时期细胞的形态学，在3组的第3代传代细胞绘制生长曲线，进行生长率的判断与计算。同时观察不同组别的ALP、OC、OPN基因表达情况。

1.3统计学处理

采用SPSS软件进行统计处理。所有数据采用x±s显示，组间差异比较，用两样本的均数t检验，P

2结果

2.1细胞形态学情况

细胞生长的形态学特点如下：具有良好状态，具有梭形形状，且放射状生长，细胞间贴附紧密，70%细胞沿细胞体的长轴排列有序（见图1），细胞具有良好的纯度。通过0.25%胰蛋白酶消化后，传代培养的骨髓基质干细胞生长明显速度增加。但传至20代左右，生长速度会逐渐减慢，细胞内产生颗粒状的堆积物。

图1传代第3代骨髓基质干细胞（×100）

2.2生长率情况

该实验分为诱导组A，即诱导培养液组，诱导组B，即含DA-2006的培养液组，对照组，即普通培养液组。通过MTT法，在3组的第3代传代细胞绘制生长曲线（见图2）

3组实验进行一周的细胞培养后，3组BMSCs细胞均出现不同程度的团块化，但诱导组B较强于诱导组A，对照组团块化程度最低（B组相比于A组，F=0.152，P=0.453），说明组B的诱导能力高于其他两组，但是无明显差异。

图2骨髓基质干细胞生长曲线图

2.3成骨分化标志基因表达情况

标志骨髓基质干细胞的成骨分化的基因有ALP[5]、OC、OPN，这些基因在骨形成中担当着重要作用。通过荧光定量PCR技术，检测这3个标志基因在添加有诱导培养液或者含DA-2006的培养液的条件下的表达变化（见图3）。结果显示对照组的表达量最低，同时组B的ALP、OC、OPN表达量明显高于组A（X2=3.621，6.521，4.052，P=0.012，0.000，0.009）。

图3骨髓基质干细胞的成骨分化标志基因表达情况

3讨论

当前骨髓基质干细胞已经被实验证实其作为载体在细胞治疗和基因治疗方面的价值[6-7]。骨髓基质干细胞相对较容易从骨髓中抽取分离，同时较容易进行体外细胞培养及转染多种外源基因。因此，骨髓基质干细胞相比HSCs在基因治疗方面有更多优势[8-10]，例如HSCs的分离需求大量的骨髓，并且这些细胞是很难大批量体外培养的。

经典的诱导骨髓基质干细胞分化成成骨细胞的方法包括流式细胞仪分离技术，密度梯度离心法，贴壁筛选法[11-12]。操作较简单的方法为贴壁筛选法，该法筛选的细胞容易成活。在细胞培养过程中，换液次数减少可以保护骨髓基质干细胞的活力。

多巴胺受体可能作为肿瘤干细胞的生物标志物。将人脐带间充质干细胞诱导分化为多巴胺能神经元并观察其中脑源性神经营养因子的表达情况，研究指出，脐带间充质干细胞经诱导后可向多巴胺能神经元分化，且分化后的细胞可表达脑源性神经营养因子。而对于诱导骨髓基质干细胞分化的方法，目前主要是利用骨形成蛋白或者地塞米松[13]进行诱导，本实验探讨人工合成的小分子化合物DA-2006的诱导作用及其机制。结果显示3组BMSCs细胞均出现不同程度的团块化，但诱导组B较强于诱导组A，对照组团块化程度最低，而且诱导组B的密集程度最高，说明含DA-2006的培养液条件下的骨髓基质干细胞的细胞活性比较强，该结果也验证了增值与分化的矛盾统一原理[14-15]。

人类的骨质是由成骨细胞进行骨质的累积和破骨细胞进行骨质的降解相平衡的一个完美的平衡过程。近年来科学家发现ALP、OC、OPN参与了肿瘤形成、细胞增殖和分化、病毒防御等几乎所有的生物学过程，它可能有非常广泛多样的生物功能。本文通过荧光定量PCR实验，检测骨髓基质干细胞在诱导分化后的相关成骨标志基因的表达变化，可以反应其成骨分化水平，骨碱性磷酸酶（LAP）作为成骨细胞表型的标志物之一[16，17]，可反映成骨细胞的活性和功能状况，主要应用于小儿佝偻病早期诊断，骨源性碱性磷酸酶从骨质中分泌，当骨头中钙盐沉淀出现不足时，分泌会增多，骨中钙盐充足则分泌减少。同时相关研究显示，在干细胞诱导分化为成骨细胞时，OPN与OC的表达水平显著上调。本文结果显示，对照组的表达量最低，同时组B的ALP、OC、OPN表达量明显高于组A。可能机制在于作为干细胞一种开关的多巴胺能控制成骨中新细胞的形成。如果多巴胺信号被抑制，它们就不能产生新的成骨细胞。

总之，本研究探讨了DA-2006对骨髓基质干细胞诱导分化为成骨细胞的作用及分子机制。研究发现在含DA-2006的细胞培养液诱导环境下，骨髓基质干细胞的成骨分化情况较强于经典的地塞米松诱导效果，其机制的发挥可能与上调ALP、OC与OPN的表达水平有关。

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干细胞培养技术范文篇3

【关键词】骨髓间充质干细胞；细胞培养；细胞鉴定

【中图分类号】R392.4【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0346-02

骨髓间充质干细胞(bonemarrow-drivedmes-enchymalstemcells,BMSCs是来源于骨髓的MSCs，具有采集方便的优点，是理想的组织工程种子细胞［1］具有多向分化和自我复制潜能,易于自体采集、无免疫排斥反应、避免伦理学限制等优点,在细胞治疗方面得到了广泛的应用。但是BMSCs在骨髓微环境中所占比例极少,使用何种简单操作方法快速获取形态均一和纯度较高的BMSCs便成为该研究领域关注的焦点［2］。本实验采用全骨髓贴壁细胞培养法和密度梯度离心法相结合分离、纯化BMSCs，通过体外培养扩增，以及流式细胞术鉴定，建立稳定的BMSCs培养扩增方法。

1材料与方法

1.1实验动物：日本大耳白兔4只，4周龄，雌雄不限，体重250~300g，购于兰州生物制品研究所。

1.2主要试剂及仪器：二氧化碳培养箱(BB16UV型,德国Heraeus公司)、超净工作台(VS-1300L型,苏净集团苏州安泰空气技术有限责任公司)、倒置相差显微镜、超声波清洗仪、纯净水系统、酸度计、台式高速离心机(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)、低糖培养基(GBICO公司)、胎牛血清（杭州四季青）、谷氨酰胺、青链霉素、胰酶、流式细胞抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.3兔BMSCs的采集：取4周龄日本大耳白兔一只，雌雄不限，20ml空针空气栓子经耳缘静脉注入，待兔死亡后，将其全部浸泡于75%酒精溶液内8~10分钟，在无菌环境下切开前后肢皮肤，切下兔前后两肢，剃去覆盖于肱骨、胫骨及股骨上的肌肉组织，注意保留骨的完整性，用组织剪分离股骨、胫骨及肱骨，将其置于无菌培养皿中，纵向依次剪开各长骨两端，5ml注射器沿剪开的骨端注入L-DMEM冲洗3次，收集冲洗液约10ml，用筛网过滤冲洗液，加入完全低糖培养基重悬组织冲洗液，吸管反复吹打混匀，1000r/min，4℃，离心5min，弃去上清。再次加入适量完全低糖培养基，吹打混匀，分别加入一次性培养皿中，放入37℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养（图1）。

1.4兔BMSCs培养：1.4.1原代BMSCs培养向分离得到的细胞组织悬液加入10ml含20%胎牛血清（Fetalbovineserum，FBS）的L-DMEM培养基重悬细胞，并转移至中号塑料培养皿内。将培养皿置于37℃，体积分数为5%的CO2孵箱中培养。培养72h后使用含20%FBS的L-DMEM完全培养基换液。原代培养5-7天后，细胞融合可达80%以上。将原代培养的BMSCs在倒置相差显微镜下观察细胞集落的形成和细胞形态（图2）。

1.4.2传代BMSCs培养待原代细胞铺满培养瓶底后，用EDTA胰蛋白酶消化贴壁细胞，FBS终止消化后将细胞悬液以1:3比例接种于新培养瓶中，加入含10%FBS的L-DMEM完全培养基5ml培养，每隔2天换液，约3-4天后细胞可铺满瓶底。将传代培养的BMSCs在倒置相差显微镜下观察细胞形态。以此方法，向后传至三代（图3、4）。

1.5兔BMSCs的鉴定

对干细胞的鉴定主要是建立在对细胞表面标记物的识别基础上，采用流式细胞仪特有的细胞分析技术，可在短时间内精确分析出细胞表型以及其所占有的比例，使用间接标记法标记CD44、CD34。取第3代BMSCs以2.0×105/mL重悬，PBS洗涤细胞3次，向细胞悬液中加入鼠抗兔CD44、CD34（稀释1:100）为一抗，4℃保存30min，加入羊抗鼠含FITC、PE的二抗，4℃避光保存30min。PBS洗涤细胞3次后放入流式细胞仪中检测。记录数据（图5、6）。

2讨论

BMSCs具有贴壁性、具有强大的增殖能力和多向分化潜能、具有免疫调节功能、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。

2.1更好地增加BMSCs的贴壁性：在BMSCs培养中，细胞贴壁培养与传代成功与否是本实验的关键。其中存在很多问题，比如在细胞贴壁方面，用一次性塑料培养皿效果要优于可重复使用的玻璃培养瓶、培养皿。塑料培养皿内壁有一层鼠尾胶原，它可以更好地促使骨髓间充质干细胞贴壁。

2.2培养基最佳的酸碱度：培养基中加碳酸氢钠的目的，是为了在二氧化碳培养箱中平衡培养基中的PH值。对于GBICO的DMEM培养基，3.7g是对应二氧化碳培养箱的二氧化碳浓度设定在10%，而5%的则对应的是2g碳酸氢钠。暴露在空气中的培养液，因为大气中二氧化碳的浓度很低，液体中的二氧化碳会气体分压高于大气，因此会逐渐溢出，浓度逐渐降低，液体的PH值也逐渐升高，如果DMEM在空气中存放时间过长，它将有可能变成紫红色。一般新配置的颜色正常，在多次开盖，培养液接触空气的时间较长后，颜色会逐渐变成紫红色，笔者的做法是，配制培养液时加hepes，用小容量的分装瓶分装，及尽量减少培养液与空气的接触时间。配培养基时，将酸碱度调至6.9-7.0，过滤后酸碱度会适当增高。

2.3传代的注意事项

2.3.1EDTA-胰酶最佳消化时间：具笔者在试验中的观察，在BMSCs传代过程中，根据培养瓶、培养皿或培养板中贴壁细胞的覆盖率确定，当BMSCs贴壁达到80%-90%就可以传代了，用玻璃尖吸管滴入EDTA-胰酶4-7滴，在倒置相差显微镜下观察，当细胞70%由原来的纺锤状、梭形变化为椭圆形时为最佳时间，一般为1至2分钟。

2.3.2加入EDTA-胰酶后的吹打时间与次数：加入EDTA-胰酶后，静置1分钟，在镜下观察细胞变椭圆或圆形，并有轻度漂浮时，用尖吸管轻轻吹打3-6次即可。

2.3.3骨髓间充质干细胞特异性标志物：虽然目前尚未发现骨髓间充质干细胞特异性标志物，Pittenger等认为CD29、CD44、CD105、CD166、SH2、SH3为间充质干细胞的重要标志物［3］。

综上所述，对BMSCs的形态学观察和表型分子鉴定实验均证实培养传代的BMSCs的生物学特性并未发生明显改变，说明本实验的分离培养扩增方法安全有效。本实验成功的建立了一系列分离、体外培养和扩增兔BMSCs的实验方法，为进一步组织工程研究奠定了实验基础。

参考文献

［1］兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性观察ProgressinModernBiomedicineVol.10NO.17SEP.20103239-3243

［2］骨髓间充质干细胞的分离、培养及生物学特性陈建梅姚荣伟李勇张馥敏江苏医药2010年10月第36卷第19期2306-2308