单细胞生物的起源范文

近年来临床研究报道异体造血干细胞移植后可发生供者细胞来源的白血病[9,10]。吴克复等[11]推测致癌因子应该源自受者细胞,即白血病患者体内的致癌因子也可能存在于除白血病细胞外的其他细胞,通过某种(些)途径传递给移植来的供者造血干细胞,导致这些移植来的细胞转化为新的白血病细胞。3.1隧道纳米管道(tunnelingnanotubes,TNT)可能是细胞间传递癌基因、癌蛋白的重要途径隧道纳米管道或简称纳米管道(TNT),是细胞膜形成的直径为50~200nm的细胞间管桥[12]。在体内淋巴细胞、单核细胞和树突细胞中均可观察到TNT,它的广泛存在提示其具有重要功能。TNT除了传送小分子物质外,还有核酸、受体、细胞器(如溶酶体、线粒体)等[13],细菌、病毒等微生物也能通过TNT传播[14]。研究[15]发现,一旦TNT建立就可以产生细胞内物质的传递,而在不同细胞间由TNT介导的瞬时融合事件同样可以传递肿瘤诱导因子。LevchnkoA等[16]报道P-糖蛋白(P-glycoprotein)可以在不同类型的细胞间转移,并导致受体细胞多药耐药性的增高。尽管这种细胞间迁移的潜在机制还不确定,但现有的数据表明其基本符合质膜成分经TNT的运输现象[17],而癌基因、癌蛋白是否能通过TNT在细胞间传输,尚有待进一步研究。3.2细胞融合与白血病复发的相关性细胞融合可能是癌基因、癌蛋白在细胞间传播的另一途径。胚胎发育过程中细胞融合是必不可少的细胞生物学机制,在组织修复和再生过程中起重要作用。但是在正常成体组织中细胞融合的发生率很低(约10-5),不恰当的细胞融合可能促进肿瘤发展。肿瘤细胞间、瘤细胞与正常细胞间融合产生杂交细胞,导致遗传重新编程,并可形成肿瘤干细胞[18]。这种肿瘤干细胞具有更强的增殖潜能以及转移、抗凋亡、多药耐药等多种恶性增殖特性,后者可表现为ABC(ATP-binding-cassette)转运蛋白表达水平的升高。吴克复等[11]报道了25份描述动物的杂交肿瘤;2例骨髓移植后患肾癌的病例证实肾癌细胞来自供者的造血干细胞,在肾脏中与转化的肾上皮细胞融合形成肿瘤细胞[19],表明细胞融合在肿瘤复发中起重要作用。

多次输血的免疫机制与急性白血病复发

在白血病治疗中采用的连续强烈化疗可以导致严重的骨髓抑制,因此输血成为白血病重要的支持治疗手段。通过大量对输血与恶性肿瘤预后的回顾性研究发现,输血病人较不输血病人肿瘤复发率高,且肿瘤复发率与输血量呈正相关。对儿童急性白血病的回顾性研究[20]也证实:急性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病患儿中,复发组输血量较未复发组大,输血次数也比未复发组多,提示输血与急性白血病首次复发具有相关性。目前认为输血主要通过以下几种机制降低机体的免疫监视功能从而增加白血病复发的可能[21,22]:(1)克隆无能,主要组织相容复合物(MHC)在抗原递呈方面的异常使T淋巴细胞不能有效地发挥功能效应,从而产生免疫抑制———克隆无能;(2)单核-巨噬细胞免疫功能降低:白细胞介素-2(IL-2)和前列腺素E2(PGE2)均是较强的免疫调节剂,输血后单核巨噬细胞产生PGE2增加,而PGE2可降低巨噬细胞II类抗原表达和递呈功能,同时抑制IL-2的产生,降低了靶细胞对IL-2的反应;(3)T淋巴细胞及亚群的改变:T淋巴细胞不仅是细胞免疫的效应细胞,也是重要的免疫调节细胞,输血后辅助性T细胞/抑制性T细胞比值下降,并使NK细胞活性低下,从而削弱了其对T细胞、B细胞、骨髓干细胞增殖凋亡的调节作用;(4)非特异性免疫功能下降:血液是一种含多种物质的混合物,不仅血液中的白细胞在免疫抑制中起作用,血浆中的微聚物可使受血者纤维结合蛋白水平降低,纤维蛋白裂解产物可使受血者中性粒细胞脱颗粒,大量红细胞输注及铁盐负荷增加使受血者网状内皮系统负荷过重导致非特异免疫功能下降。

急性白血病复发的克隆演化机制

通过对8例AML患者复发前及复发后肿瘤细胞全基因组进行测序,并与同一患者健康体细胞的基因序列进行对照研究,揭示了白血病克隆演化的两种模式:(1)疾病发展演化中的主克隆/亚克隆优势选择。复发时白血病克隆已发生演化,但仍保留以前主克隆的某些免疫学和基因特征,化疗缓解后,白血病主克隆已明显受抑,但某个耐药寡/亚克隆在缓解中持续存在,并进一步增殖导致克隆演化和白血病复发。(2)白血病起病时存在的寡/亚克隆在疾病发展过程中被选择出耐药优势克隆。在疾病发展过程中由主克隆演化的耐药亚克隆增殖而导致克隆演化。研究[25]还显示,复发次数越多,发生克隆演化比例越高。但关于克隆演化与AL复发的关系尚需更大样本病例及更长随访时间的观察。

化疗与急性白血病复发的关系

AML复发患者中的突变不同于那些存在于原发瘤的突变,前者更容易出现DNA损伤的标记[24]。在肿瘤化疗中,普通的肿瘤细胞对治疗敏感,容易被消灭,但肿瘤干细胞具有很强的耐受力,会继续产生新的肿瘤细胞。ZengYX等[30]提出肿瘤细胞的一个重要特点就是基因组不稳定,可以演变成为各种基因型,那些与干细胞表型相似的肿瘤细胞能够耐受化疗,成为复发和转移的“种子”,并指出化疗一方面可能消灭肿瘤细胞,另一方面也可能加剧基因组不稳定性,诱导普通肿瘤细胞演变成干细胞样肿瘤细胞。WangJ等[31]将来源于单个普通肿瘤细胞的单细胞克隆用化疗药物处理,发现其能明显诱导生长能力特强、能抗拒化疗的干细胞样肿瘤细胞产生,并提出化疗后普通肿瘤细胞演变成肿瘤干细胞是肿瘤复发的根源。但至今尚没有直接证据证实化疗可以决定肿瘤细胞的演化并促成疾病的复发。

单细胞生物的起源范文

AbstractItisquickconvientgood-repeatingandcheapthatexaminingthebioticmaterialscompatibilitythroughcell-culturingmethod,anditismoreandmoreimportantinevaluatingthecompatibilityofbioticmaterial.Thenewmaterialappeatingcontinouslycomplicatingofthepartandaimmaterialbeplantedintheintensityofmaterialstoxiceffectthereactionscomplicationofmaterialandbioticbody,allofthesedecidethevarietyofexperimentmethodandcellsincelltoxicityexperiment.Itisveryimportantthatchoicestherightexperimentmethodandcellsaccordingtothematerialscharacterthepartandaimthematerialbeplantedin.Theevaluationofbioticmaterialscompatibilitystressedonthechangingofcellsformandquantitybefore.Inrecentyears,moreandmorereportsappearaboutmaterialinflueancesthegrowth.adhesionproliferationandmetabolizingofcell.andpresentsthepointthattheevaluationstandardofbioticmaterialscompatibilityshouldbesetaccordingtotheactivecellsquantityandtheirbiningmanysubjectstechnologicaldevelopment,suchasimmunology,chemistry,radiationandshadowgraphy,thoroughlyinquiresthechangeingrelationofcellsstructureandfuntion,furtherlyclarifesthematerialseffectoncell,Itisthedevelopingdirectioninthefuturethatevaluatesthebioticmaterialscompatibilityincedd-culturingmethod.

KeywordsBioticmaterialCell-culturingCompatibilityToxicityexperiment

生物材料的临床应用已有较长的历史，广泛应用于牙科、眼科、整形外科及心血管外科领域。目前美每年有2-3百万人工脏器或假肢植入人体中。生物材料不仅要具有临床使用时所需要的理化性能，还必须具有良好的生物相容性，以保证使用安全。如何快速准确地评价材料的生物相容性，对于研制新材料和缩短研究周期起着重要的作用[1]。

根据1982年美国国家标准学会和牙科协会（ANSI/ADA）公布的评价生物相容性实验标准草案，评价生物相容性的实验方法有全身毒性试验（口服法）、急性全身毒性试验（静脉注射法）、吸入毒性试验、溶血试验、皮下植入试验、骨内植入试验、过敏试验等[2]。细胞培养法作为检测材料毒性的手段（亦称为细胞毒性试验），具有简便、敏感性高、节省动物、节约经费、缩短生物材料研究周期等优点，正日益受到人们的广泛重视。本文就该研究领域近几年的发展及动向作一简介。

1细胞毒性试验方法的进展

1948年RosenBluth等首次报道利用鼠成纤维细胞培养来筛选聚合物，开始了细胞毒性试验评价生物材料的生物相容性的研究与应用工作，迄今为止这方面已有大量的工作积累与研究发现。细胞毒性试验在评价材料生物相容性地位已得到公认[3]。由于目前对生物相容性概念及机理还完全了解，加之材料的多样性、置入要体内环境中的变异性、材料与机体作用的复杂性等因素，故迄今为止，国内外还没有一个统一细胞毒性试验方法。

细胞毒性试验由于细胞培养方式（如单层细胞培养、细胞悬液与材料混合培养、细胞在材料上培养等）的不同，细胞与材料之间有无间质（即细胞直接与材料或其浸出液接触，还是通过间质接触）以及材料毒性成份（即材料本身、浸出物、扩散物或材料降解产物等）不同决定了细胞毒性试验方法的多样性。根据细胞和材料之间有无间质可以将细胞毒性试验方法分为间接法与直接法两大类。

1.1间接法

最典型的间接法是琼脂覆盖法，该法是Dubecco在1952年首先提出[4]。其方法是将含有培养液的琼层平铺在有单层细胞的培养皿中，再在固化的琼脂层上放上试样进行细胞培养。此法优点是不管试验材料是什么形态（膜、粉末或油脂状）等都适用。但该法敏感性受试样溶出物琼脂层上扩散程度的影响。当溶出物分子量小，易溶于水，其毒性发现早且较强。反之即使有毒的材料，如溶出物分子量大并难溶于水，使用该法时材料毒性就难以表现出来。

为克服琼脂法的缺点，SabitaSriva等提出分子滤过法[3]。该法是在单层细胞上覆盖一层丙烯盐制成的微孔滤膜，将试样材料放在滤膜上，使材料毒性在成份通过滤膜作用于其下的细胞。由于滤膜微孔直径约0.45μm,Bondemark认为该法适合评价毒性成份分子量小的材料的相容性[5]。vanLuyn等1992年报道用甲基纤维素细胞培养法评价聚合物的细胞毒性[6]。该法是在甲基纤维素中混入细胞表面进行培养。该法优点是生物材料的水解及细胞坏死释放出的蛋白分解酶引起的酶解作用均要发生，因此可同观察到生物材料的原发性及继发性细胞毒性。

1.2直接法

生物材料中一些易溶出物质引起炎症反应和组织反应的主要原因。易溶出物质一般是原料单体、低分子聚合物、催化剂、溶剂、稳定剂、乳化剂等。为研究这些溶出物的细胞毒性，一些学者提出浸出液法。该法是将试样投入培养液或蒸馏水中适当条件下进行浸泡，制备出含有溶出的浸泡液再将浸了液加在含有细胞的培养皿或试管中继续培养，观察溶出物对细胞的影响。Oshima认为不同浸提条件和浸提方式所制备的材料溶出物在细胞敏感程度上并无显著性差异[7]。

直接浸渍法：该法是形态不规则的试样（如金属粉末、油脂类材料）等与细胞一起放入培养皿中进行培养。当有溶出物时试样周围的细胞就会受到影响。宁淑华等1988年用该法对医用硅胶及聚乙烯醇进行细胞毒性试验[8]。作者认为对于形态不规则有微量毒性的材料使用该法较为适宜。

另一些学者在直接法基础上提出直接接触法。该法将细胞直接放在生物材料上进行细胞培养。当有毒性物质释放时，由细胞形态变化和数量增减检测细胞毒性程度，同时可以直接观察到细胞在材料表面贴附情况。直接接触法不仅能直接检测材料溶出物的细胞毒性，同时也是考察材料与组织细胞相容性的重要手段。通常“材料生物相容性好”，很多场合都是指细胞容易贴壁且能迅速繁殖生长。因此可根据直接接触法细胞培养的结果推测材料植入人体后与机体细胞的反应。但是，对于与血液接触的循环系统来说，为了避免引起血栓形成，就希望细胞难以贴壁且不易增殖。因此应根据材料的使用目的，作出相应的生物相容性判断。

Tsuchiya[9]等于1994年对琼脂法、分子滤过法、浸出液和直接接触法对材料的细胞毒性敏感程度的差异性进行比较。作者认为浸出液法适合检测材料溶出物毒性，并与动物毒性试验结果相符合。直接接触法对材料的细胞毒性敏感性最高，可测出材料微弱的细胞毒性。琼脂法适合对毒性大的大指材料进行筛选。分子滤过法适合毒性成份分子子量小的材料进行生物相容性评价。

综上所述。细胞毒性试验方法多种多样，并各有其特色。每种试验方法因其原理及方法不同，选择材料的针对性也不同。根据实验材料本身理化性质、毒性成份表现形式、毒性作用强弱及材料用途选择正确的实验方法是至关重要的。

2实验细胞研究进展

目前细胞毒性试验中应用最早的及使用最广泛的细胞是L-929细胞，该细胞是Earle等1948年从小鼠皮小组织中分离出的成纤维细胞。另一种应用较多的细胞是Gey等1953年从人类子宫肿瘤中分离出的子宫粘膜上细胞（HeLa细胞）[10]。由于这两种具有传代容易，繁殖迅速、体外培养条件低、易储存，同时这两种已建立成系的细胞株能为实验提供稳定传代的细胞，能为许多材料细胞毒性评价所共用等优点。1982年美国质量标准协会将L-929细胞和HaLe细胞推荐为细胞毒性试验中的标准细胞[2]。

由于L-929细胞来源于小鼠的皮下组织，HaLe细胞来源于人的肿瘤组织。这两种已建立成系的细胞株都具有无限分裂增殖类似肿瘤细胞的特征。因此人们对利用这现两种细胞代替人体正常组织细胞评价材料的生物相容性的敏感性及可靠性产生了疑问。同时随着不断涌现，人们对材料植入人体后与机体组织之间可能发生的反应其对材料的影响产生了浓厚的兴趣。因此单用L0929和HaLe细胞培养检测材料的生物相容性已不能满足人们的这种需要。

从九十年代起越来越多学者根据材料植入体内的不同部位及使用目的选择人体不部位或/和组织来源的细胞作业实验细胞，使体外细胞培养对机体内环境的模拟更趋真实，其结果更为准确与客观。

对宿主而言植入宿主体内的生物材料是种异物，因此材料植入体内最普遍和最常见的反应是免疫排斥反应。由于单核巨噬细胞来源于人体的血液，在人体免疫系统中起着重要的作用，能释放各种刺激因子激活补体引起急慢性炎症反应，同时刺激成纤维细胞生长促进伤品的愈合。因此选择单核巨噬细胞作评价材料细胞毒性的实验细胞，有助于人们了解材料置入体内引起的炎症反应对组织细胞的影响[1]。

Cheung认为不同组织来源的细胞材料的敏感性是有差异的[12]。只用软组织来源的细胞培养检测材料的细胞毒性尚不能全面反映出材料的生物相容性。以骨替代材料和牙用材料为例。前者种植到骨组织内，所接触的是骨环境，而后者存在于软组织环境中。因此骨替代材料应选择骨组织来源的细胞，因为这种细胞在体外培养中可形成体内环境一致的矿物化小结，这种小结内含有类成骨细胞和类骨髓细胞及钙化的胶原基质，使体外细胞包培养更好地模拟了生物材料与骨组织在体内的反应。牙用材料可释放一些可溶性的毒性成份如Na+、Ca2+、Al3+和氟化物等[]14，这些可溶物质主要影响邻近的牙组织及口腔粘膜的上皮细胞、成纤维细胞及各种免疫细胞，并对这些细胞的生长、附着增殖及代谢等功能产生影响。因此对牙材料采用口腔粘膜的成纤细胞或/和上皮细胞才能更准确地反映出材料的生物相容性。

3细胞毒性的观察方法

以往对材料生物相容性的评价往往着眼于细胞的形态与数量，通过细胞形态的改变和数量的增减判断材料的细胞毒性[15]。由于材料毒性成份对细胞的损伤，首先发生细胞生物化学反应和生物分子结构的改变，出现代谢和机能的改变如线粒体氧化代谢障碍、蛋白质合成下降，细胞膜选择性通透屏障作用消失等，这种变化用形态学方法通常不能发现。只有当细胞死亡10h以上，细胞的自溶性变化相当明显的才能在光显微镜下根据细胞死亡的判断特点，即核浓缩、核碎裂、胞浆伊红染色等判断材料的细胞毒性程度。因此传统的细胞毒性观察方法不能及时、准确地判断材料的细胞毒性。

九十年代以来，越来越多学者倾向于从材料毒性成份引起细胞死亡所产生的细胞形态和数量的变化评价材料生物相容性转移到材料对细胞的生长、附着、增殖及代谢功能的影响，并提出了以存活的有功能的细胞或/和细胞生长增殖情况作材料的生物相容性评价指标。

在体外细胞培养中已有学者提出一些能敏感地反映细胞活力功/和细胞殖的实验室评价方法。如放射性位素（3H-胸腺嘧啶，3H-亮氨酸等）摄入法[16]、荧光染色法（如乙酰乙酸荧光素）[18]、流式细胞光度术等[19]。这此方法各有其优缺点及适用范围。

放射性同位素摄入法是在培养基中掺入3H-胸腺嘧啶或/和3H-亮氨酸等，根据3H-胸腺嘧啶在细胞内含量测量DNA的合成含量，3H-亮氨酸含量测定细胞内蛋白质合成清况[16]。该法能揭示细胞分子水平的动态变化，是研究细胞代谢状态的重要手段。但同位素物质对研究人员会造成一定程度的放射性损害，同时需要特殊设计的实验室和一些特殊设备是其缺点。

四甲基偶氮唑盐微量酶反应色法（MTT法）是由Mosroann在1983年提出，最初应用于免疫学领域，近年一些学者将该法应用到生物相容性评价中[20]。其原理是线粒体琥珀酸脱氢酶能催化四甲基偶氮唑盐（MTT）形成兰色甲替。形成数目的多寡与活细胞数目和功能状态呈正相关，该法简便迅速、不接触同位素、而敏感性同位素法接近。该法缺点是甲替有时易聚集成团影响结果的难确性。

荧光染色法：其基本原理是当细胞受到损伤时，细胞膜的选择通透性屏障作用消失，利用乙酰乙酸荧光素和溴化乙锭快速进出细胞膜受损的细胞特点。在荧光显微镜下迅速区分受损细胞[22]该法特点适合评价首先影响细胞膜功能的材料的生理相容性。

流式细胞光度术（Flowcytometry,FCM）是近几年迅速发展起来的分析细胞的方法[22]。该法利用鞘流原理，使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单列，按重力方向流动。细胞被激光照射后反射荧光，检测器械可逐个结细胞的荧光强度进行测定。FCM对细胞测定能力30-60万个细胞/分钟，同时可对细胞的核酸，蛋白质、酶、细胞周期分布等八种量进行测定。该法在材料的生物相容性评价中有着广泛的应用价值。

单细胞生物的起源范文篇3

摘要：目的：探讨人脐血单个核细胞的分离培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA的表达，并观察其致瘤性。方法：使用密度梯度离心法得到脐血单个核细胞，用体外贴壁生长的方法获得脐血间质干细胞(MSCs)。观察培养过程中脐血MSCs形态的变化，通过流式细胞仪检测干细胞表面抗原的表达。使用NGF和RA联合诱导后，用RT―PCR方法鉴定诱导前后神经干细胞(NSCs)标志物巢蛋白(Nestin)及Musashi-1蛋白mRNA的表达；收集培养后7d的MSCs，接种于裸鼠皮下，观察是否有增生物的出现，并观察细胞组织形态学变化。结果：脐血单个核细胞贴壁生长后大部分细胞呈梭形，诱导后可分化为神经元样细胞。流式细胞仪检测该细胞不表达CD34，CDlla和CD11b，强表达CD29，符合MSCs特征。诱导后，NSCs表面标志Nestin及Musshi-1表达明显增强(P＜0.05)，48h达高峰，然后逐渐减弱：细胞接种后12周，在裸鼠皮下不能形成肿瘤，与对照组相比，细胞形态学未出现恶性变化。结论：脐血中存在MSCs。分离后可以体外扩增，诱导后分化为神经元样细胞，并表达NSCs表面标志。在裸鼠体内不具有成瘤性。脐血能够成为NSCs的新来源。

关键词：脐血单个核细胞；神经干细胞；诱导分化；巢蛋白：致瘤性

中图分类号：R741

干细胞是指具有自我更新与多向分化潜能的细胞，它们在细胞疗法、基因治疗、发育学研究、药理及毒理学等研究中己显示出无可比拟的作用和优越性。近年来，神经干细胞fneuralstemeells,NSCs)移植治疗中枢神经系统疾病引起人们的普遍关注，在动物实验中获得了较好的疗效，NSCs被认为是治疗神经系统疾病的良好载体。但是，由于来源的局限，NSCs的应用受到限制。成体干细胞是存在于发育成熟个体组织中的可自我更新和分化为原组织所有细胞类型的未分化细胞。根据其发育潜能可分为全能干细胞、多胚层多能干细胞、单胚层多能干细胞和定向专能干细胞。存在于骨髓基质中的间质干细胞(mesenehymalstemcdls,MSCs)是研究最早和最为深入的一类多能干细胞，其来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有广泛的分化潜能，已经有多项研究显示，外源骨髓MSCs移植入脑内，可以分化为神经细胞。表达神经元特异性标志蛋白。因为脐带血来源的MSCs和骨髓MScs有极其一致的生物学特性，且易于采集、制备及保存。免疫反应性低，因此可能更易于在临床上使用。本研究结合密度梯度离心和体外贴壁生长的方法得到脐血MSCs，诱导后检测其NSCs标志物Nesfin及Musashi-I的表达情况，并将培养后的脐血MSCs接种于裸鼠皮下，观察脐血MSCs对裸鼠的致瘤性，为应用于组织及其功能修复中提高该细胞的生物安全性提供新的依据。

1．材料和方法

1．1主垂试剂

高糖IMDM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；淋巴细胞分层液(Cibco公司)；RNA提取试剂Tfizol(invit-rogen公司)；氯仿、异丙醇为国产分析纯试剂；DEPC水(sigma公司)；RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)；琼脂糖(sigma公司)。

1．2实验方法

1．2．1脐血间质干细胞的体外分离和扩增培养无菌条件下采集健康产妇足月妊娠顺产或剖腹产的婴儿脐带血50～100md肝素抗凝，与0.01moL/pH7.4的PBS按1:1混匀，再与3％的明胶1:1混匀，静置60min沉降红细胞。吸上清离心，弃上清，用PBS制成单细胞悬液，叠加到相对密度1.077的淋巴细胞分离液上，2000dr/min离心20min，取界面层，加PBS制成单细胞悬液，离心洗涤3次，弃上清。所得细胞以1.0x102／cm2(T-25培养瓶)的密度接种于含有15％胎牛血清的IMDM培养液(Hyclone公司，置于37℃、体积分数为5％的cm2、饱和湿度的孵箱内培养，3d后换液，弃去悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，用倒置显微镜观察细胞形态的改变并照相。待细胞长到80％融合时，用2.5g/L的胰蛋白酶消化后传代。

收集分离后1h、培养后36、48、72h和5d的细胞，离心洗涤，在显微镜下，台盼蓝染色、计数，调整细胞密度备用。

1．2．2流式细胞仪检测取扩增一代的脐血间质干细胞，PBS洗涤后用2．5WE的胰蛋白酶消化后制成1:0x106的单细胞悬液，共7管，1号管和2号管为阴性对照，分别加入抗鼠的IgG-FITC和IgG-PE单克隆抗体各5ml，其余5管分别加入抗人的CD34-PE，CD31-FITC，CDl3-PE，CD29-PE，CD44单抗各5m1．室温下孵育20min，流式细胞仪检测。

1．2．3脐血间质干细胞的诱导分化取原代细胞，加入20ng/m1NGF和RA联合诱导培养，收集诱导前，诱导后36、48、72h、5d的细胞，调整细胞密度备用。

1．2．4RNA提取取诱导前，诱导后36、48、72h、5d的细胞各3x106个，融于1mlTRIZOL试剂中，用吸管反复吹打后室温下孵育5min。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡后室温下10min。4℃，12000r/min离心15min后将上层无色液体移入新的EP管中。加入异丙醇，室温下放置10min，4℃，12000r/min离心10min弃去上清。加入75％乙醇，4℃，7500r/min离心5min，弃去上清液，风干，加入DEPC处理的纯净水40μl溶解后，55℃孵育15min。

1．2．5RT-PCR采用相关软件设计引物，并由赛百盛生物工程公司合成。Nestin上游引物：5TCCTTTGACTTrCCTTGTC―TACCTCC3，下游引物：5AAATCTGAAACTCAAGCACCA3：Musashi-l上游引物5TAATTCCTGTCCAGCAGTCTC3：下游引物5GAACCATCCCGTCCTGTATCAT3。对所提RNA进行定量，取1μgRNA转录成cDNA，在EP管中先后加入MgCL2×PCRbuffer1μl，RNasefreeH2O3.75μl，dNTPlμ，RNaseinhibor0.25μl，AMV逆转录酶0.5μl，oli-．go-dT接头引物0.5μl，RNA样品1μg，按照如下条件进行逆转录反应30℃10min，48℃50min，99℃5min，50℃5min。合成的cDNA进行PCR扩增。在EP管中依次加入下列物质：Taq酶0.25μl，10xPCRbuffer10μl，纯净水27.75μl，

特异性上下游引物各0.5μl。内对照GAPDH上下游引物各0.5μl(30μmol/L)，cDNA产物10μl，按照以下条件进行PCR反应。94℃预变性5min，94℃30s，57℃30s，72℃30s，30个循环后，72℃延伸7min。取5μlPCR扩增产物加样至含溴化乙锭(EB)20g/l的琼脂糖凝胶中，在5V/cm下电泳60min，紫外透视仪下观察结果，并用凝胶扫描成像系统照相，PCR定量分析软件进行分析。

1．2．6致瘤性取18只BALB/C裸鼠，随机分为3组，背部皮下组、颈部皮下组、对照组各6只。收集培养7d的MSCs，用PBS重悬并调整细胞密度为1x107/ml，非麻醉状态下，于裸鼠背部及颈部皮下分别无菌注射细胞悬液0.5ml，每只各4点．注入生理盐水作为对照组。定期观察，于3d、2周和8周取材，制作冰冻切片，HE染色，镜下观察。之后继续观察裸鼠生长情况至12周。

1．3统计学方法

数据以x＋s表示。采用SPSSl2.0软件对数据进行重复测量数据的分析，显著性水准取α=0.05。

2．结果

2．1脐血单个核细胞体外分离、培养后形态改变

培养前，脐血单个核细胞胞体较小，呈大小均一的圆形，直径约17μm，颜色较深，住高倍镜下可见其不停振动；培养后，细胞胞体增大，有破骨样细胞和梭形细胞两种形态。破骨样细胞胞体较大，呈圆形，多个核。梭形细胞大小不等。形态类似于骨髓MSCs，但较骨髓MSCs稍小。随着时间的推移，破骨样细胞减少而梭形细胞增多，即所需要的间质干细胞

2．2脐血干细胞的鉴定

流式细胞仪检测显示，扩增后的脐血MSCs既不表达造血干细胞的特异性表面标志CD34，也不表达内皮细胞的表面标志CD31，而CD29，CDl3，CD44等间质干细胞的表面标志均为阳性。这表明脐血MSCs是脐血中一群区别于造血细胞的处于未分化状态的非定向干细胞。

2．3诱导后NSCs标志物的表达

Nestin和Musashi-1作为NSCs的标志物已经得到广泛应用。通过RT-PCR检测诱导后这两个基因的表达，使用PCR定量分析软件，分析各样本的PCR光密度。将各样本的PCR光密度值除以内参GAPDH的PCR平均光密度值，重复测量5次。结果发现NestinRNA在诱导前细胞中低表达，诱导后36h逐渐升高(p＜0.05)，72h后开始降低(p＜0.05)：Musashi-1RNA在诱导前细胞中低表达，诱导后48h呈高表达(P＜0.05)。

2．4致瘤性

于注射后3d、2周和8周取材，肉眼观察裸鼠背部无明显增生物形成。组织学观察接种3d局部有细胞团块存在，团块中心细胞部分坏死。2周时，细胞团块不明显，大部分细胞被吸收。8周时，接种区组织结构与未接种区无明显区别。裸鼠存活12周以上，未见有肿瘤形成。与对照组比较，生长情况与皮肤状况无明显差别。

3．讨论

NSCs具有自我更新和多分化潜能，为神经系统疾病如帕金森病、阿尔海默病、卒中的功能重建带来了希望。无论是作为脑组织移植的供体，还是作为体内诱导分化的靶细胞，NSCs都为中枢神经系统功能重建和神经再生提供了一条新的途径。但NSCs来源有限，不适于展开大规模临床应用。如何获取大量的NSC供临床使用已成为当今干细胞研究的热点和难点。近年发现骨髓MSCs和造血干细胞(hematopoldiestemcells，HSCs)可分化成神经细胞。由于脐血MSCs和骨髓MSCs有极其一致的生物学特性，脐血中的干细胞可能更原始，增殖分化能力更强；而且脐血来源广泛、取材方便，所含有的干细胞数量更多。因此使用脐血干细胞定向诱导分化为NSCs用于临床研究有广阔的应前景。

目前国内外学者已经使用多种方法从脐血中分离干细胞，最常用的方法是利用脐血干细胞体外贴壁生长的特性，将其从造血系统细胞中分离。此外，还可利用密度梯度离心、流式细胞仪分离法和免疫磁珠等方法。最近，有学者采用负极免疫筛选及限制性稀释的方法，分离得到脐血干细胞，使用流式细胞仪和免疫磁珠分离干细胞，操作方法复杂，花费高昂而且实验条件要求高。本实验结合使用密度梯度离心和体外贴壁生长的方法获得脐血MSCs，简单有效，成本低廉，对细胞损伤小，既适合各级实验室进行基础研究，也适合大规模将脐血细胞分离纯化，用于脐血干细胞建库㈣，应用于临床。

成功分离脐血干细胞后，使用NGF和RA联合诱导培养，用RT-PCR和免疫组织化学法检测神经干细胞表面标志物巢蛋白(Nestin)和Musashi的表达。NeSin最早由Lendahl等发现，其表达始于神经胚形成时，当神经细胞迁移基本完成后，巢蛋白的表达量逐渐减少，并随神经细胞分化的完成而停止表达。此外，Sakakibara等亦鉴定出一种RNA结合蛋白Musashi，作为神经干细胞的标志物，Nestin和Musashi作为早期原始神经细胞的标志物已被广泛地应用于NSCs的鉴定。本研究发现新鲜分离的脐血干细胞弱表达Nestin.不表达Musashi-I；诱导后，脐血干细胞的Nestin和Musashi-1表达域逐渐增强，48h达到最强，进而逐渐减少。这表明脐血细胞具有向神经细胞分化的潜能。