生物细胞的培养范文篇1

目的研究新型格列酮类化合物ANY2对原代大鼠前体脂肪细胞糖脂代谢的影响。方法①用Ⅱ型胶原酶消化法得到原代大鼠前体脂肪细胞接种于24孔细胞培养板，以诱导培养基诱导分化，油红O染色法观察化合物ANY2对前体脂肪细胞分化的影响，并用异丙醇萃取油红O测定吸光度，比较各组分化程度。②以高浓度地塞米松作用于分化的脂肪细胞，制备胰岛素抵抗模型，观察化合物ANY2对胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖消耗量(GC)和游离脂肪酸(FFAs)溢出量的影响。结果浓度为1.1mg·L-1的化合物ANY2能显著促进前体脂肪细胞分化，分化率高达152%，提高其储脂能力，增加小脂肪细胞数量；提高胰岛素抵抗脂肪细胞糖耗量达363mg·mgpro-1，减少其游离脂肪酸溢出，溢出量仅69mmol·mgpro-1。结论化合物ANY2可促进原代前体脂肪细胞分化充脂，并改善高浓度地塞米松所导致的胰岛素抵抗作用。

【关键词】原代前体脂肪细胞；分化；脂肪酸溢出；胰岛素抵抗

EffectofNovelThiazolidinedioneANY2onGlycometabolismandLipidMetabolisminPrimaryPrecursorAdiposeCells

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofanovelthiazolidinedioneANY2inprimaryprecursoradiposecells.Methods1.Usingenzyme-digestingmethod，primaryprecursoradiposecellsfromtheratadiposetissueswereculturedin24wellsCulturePlate.UsingculturemediumtoinducethetransformationofthecellsandstainedwithoilredOtocontrastthedifferentiation.2.DifferentiaedcellswereexposedtohighconcentrationofdexamethasonetobuildmodelofInsulinresistancecells.TheeffectsofANY2，includingglucoseconsumption(GC)andFFAsreleastionweretestedinthismodel.ResultsANY2couldsignificantlypromotethedifferentiationonprimaryprecursoradiposecells，increaseconsumptionofglucose［363mg·(mg·pro)-1］andreduceFFAsreleastion［69mmol·(mg·pro)-1)］underthestateofinsulinresistance.ConclusionCompoundANY2hasremarkableeffectsonimprovinginsulinresistenceinadiposecells.

Keywords:primaryprecursoradiposecells;differentiation;FFAsreleastion;insulin-resistance

脂肪组织具有重要的内分泌功能，由它产生众多的细胞因子和炎症因子，通过内分泌旁分泌和自分泌途径广泛影响机体物质和能量代谢过程，参与炎性反应，引起以代谢综合征、2型糖尿病为代表的胰岛素抵抗相关疾病的发生。

本实验以原代大鼠前体脂肪细胞为研究对象，观察新型格列酮类化合物ANY2对正常状态下脂肪细胞分化的影响及胰岛素抵抗状态下对细胞代谢活动的影响。

1材料与方法

1.1药品和试剂

DMEM培养基，GIBCO公司；HEPES，Merk公司；Ⅱ型胶原酶，胰蛋白酶(1∶250)，AMRESCO公司；游离脂肪酸(FFAs)测定试剂盒和考马斯亮蓝法总蛋白测定试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供；葡萄糖试剂盒，由上海科欣生物技术研究所提供；胰岛素注射液(江苏万邦生化医药股份有限公司，400单位，10mL，批号070603)；匹格列酮，上海兰生股份有限公司提供；ANY2由中国药科大学药物化学教研室提供，纯度为98.5%。其余试剂均为市售分析纯。

吡格列酮和化合物ANY2均用二甲亚砜(DMSO)助溶，再用PBS稀释至终浓度1.1mg·L-1（DMSO终浓度＜0.01%）。

1.2仪器和用具

精密电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；LS-1F型超净工作台(上海索谱仪器有限公司)；YCP-200型CO2细胞培养箱(上海易亮医疗器械有限公司)；倒置显微镜(Olympus公司)；全波长酶联免疫检测仪(ThermoElectionCorporation)。

1.3实验动物

清洁级SD大鼠，雄性，体重250～300g，由河南省郑州大学动物实验中心提供，SCXK(豫)2005-0001。

1.4实验方法

1.4.1原代前体脂肪细胞的提取［1］

SD大鼠1只，雄性，体重（250±30）g，脱颈椎处死，75％(v/v)乙醇浸泡约1min后在超净台无菌条件下打开腹腔，用眼科剪剪下二侧附睾脂肪垫(注意避开血管和附睾)。冰无菌生理盐水洗涤脂肪垫3次，眼科剪剪碎成约0.5mm×0.5mm×0.5mm～1mm×1mm×1mm大小均匀的小颗粒，以1000r·min-1离心5min，取上层的纯脂肪颗粒于50mL圆底聚丙烯塑料管内，加入2倍于脂肪组织块体积1mg·mL-1的Ⅱ型胶原酶溶液进行消化，置37℃5%CO2条件下孵育，每5min震摇1次，直至脂肪组织块呈絮状，约需40min，取出塑料管，消化液过150目不锈钢筛网，并不断用滴管吹打以利于细胞过筛，过筛后的细胞悬液收集于15mL塑料离心管，以1000r·min-1离心5min，弃去上层脂肪层和液体，细胞沉淀用PBS缓冲液清洗，1000r·min-1离心5min，重复1次；细胞沉淀悬浮于含5%小牛血清的H-DMEM培养基中，置37℃5%CO2条件下培养。

1.4.2原代前体脂肪细胞的接种

将细胞接种于培养瓶中，加入原代培养基(H-DMEM培养基中另含有100U·mL-1青霉素加100U·mL-1链霉素)，在37℃孵箱(5%CO2加95%空气)中培养细胞，每2天换液1次，待细胞生长至接近完全融合时(设定为第1天)开始传代并诱导分化。

1.4.3脂肪细胞鉴定［1］

油红O染色移去细胞培养基，用PBS洗细胞2次，每孔加10%福尔马林溶液，置室温条件下固定40min后，PBS洗3次，每孔加入200μL油红O溶液浸染30min；PBS洗2次，显微镜下观察，脂肪细胞中脂滴被染成红色，图1(见封4)。

1.4.4最佳分化条件的选择

将消化后的细胞以5×105个·mL-1均匀地接种于24孔细胞培养中，待细胞生长贴壁后，加入转化培养基培养(H-DMEM培养基中含不同浓度的胰岛素和地塞米松，见表1)，96h后，撤去胰岛素和地塞米松，每2天换培养液1次，至细胞融合，同时设立基础培养基对照组。油红O染色后，异丙醇萃取，萃取液于510nm测定吸光度值，确定最佳细胞分化条件，即诱导培养基；在后续的实验中，以诱导培养基培养的细胞组为诱导组。

1.4.5地塞米松诱导胰岛素抵抗及其检测［2］

诱导分化的细胞中加入1μmol的地塞米松，此为模型组(同时设立无地塞米松对照组)，持续作用4d，每2d换液1次，取培养上清，GOD-POD法的微量化测定法检测培养上清中的葡萄糖含量，以培养基中的葡萄糖的消耗量反映胰岛素抵抗（IR）的程度。

1.4.6新型格列酮类化合物ANY2对原代前体脂肪细胞分化的影响

取未分化的脂肪细胞以1×105个·mL-1接种于24孔培养板中，分为对照组、诱导组、匹格列酮组和ANY2组，每组4孔。细胞贴壁后，除对照组外，其他3组加入诱导培养基和相应的药物，作用4d。撤去诱导培养基和药物继续培养至细胞融合，弃去培养液PBS洗2次10%福尔马林室温条件下固定30minPBS洗3次每孔200μL油红O浸染细胞，室温放置20minPBS洗2次每孔加300μL异丙醇萃取，室温放置20min，100μL转移于洁净96孔培养板，510nm测定吸光度值，确定细胞分化情况。

1.4.7新型格列酮类化合物ANY2对原代IR脂肪细胞代谢作用的影响

取未分化的脂肪细胞以1×105个·mL-1接种于24孔培养板中，分为对照组、诱导组、模型组、匹格列酮组和ANY2组，每组4孔。细胞贴壁后，除对照组外，其他4组加入诱导培养基作用4d；撤去诱导培养基继续培养至细胞约80%融合；模型组、匹格列酮组和ANY2组均加入1μmol·L-1的地塞米松，每2天换液1次，作用4d，复制IR细胞模型；各组细胞均换入基础培养基，并且匹格列酮组和ANY2组分别加入相应药物，作用2d。培养结束后，取各组细胞培养上清检测葡萄糖的消耗量和FFAs溢出量。

1.5统计学方法

实验数据均以均数±标准差(±s)表示，以t检验分析组间差异，P＜0.05为差异有显著统计学意义，P＜0.01为差异有非常显著统计学意义。

2结果

2.1脂肪细胞鉴定

显微镜下观察，原代脂肪细胞为梭型或三角形，经过诱导，细胞分化充脂，细胞内有脂滴形成，经油红O染色后，脂滴被染成红色(图1，见封4)。

2.2前体脂肪细胞最佳分化条件

脂肪细胞经油红O染色后，异丙醇萃取，510nm处读取OD值；各组OD值与对照组OD值的比值为分化比例，比较不同浓度胰岛素和地塞米松对前体脂肪细胞分化作用的影响。

结果可见，不同浓度胰岛素和地塞米松均可以引起大鼠前体脂肪细胞分化，但分化程度有所不同。当胰岛素浓度为5×10-8mol·L-1，地塞米松浓度为0.01μmol·L-1时，前体脂肪细胞分化程度最高，由此条件培养的细胞为诱导组(以下实验均以此条件进行)，见表1。表1不同浓度胰岛素和地塞米松对前脂肪细胞分化的作用(略)

2.3新型格列酮类化合物ANY2对前体脂肪细胞分化的影响作用

脂肪细胞经油红O染色后，异丙醇萃取，510nm处读取OD值；各组OD值与诱导组OD值的比值为分化率，比较匹格列酮和ANY2对前体脂肪细胞分化作用的影响。

结果表明，匹格列酮和ANY2均可促进大鼠原代前体脂肪细胞分化充脂，并增加小脂肪细胞数量；与诱导组比较，差异有显著统计学意义(P＜0.05)，见表2。表2化合物ANY2对前体脂肪细胞分化的影响作用(略)

2.4新型格列酮类化合物ANY2对原代IR脂肪细胞FFAs溢出及糖耗量的影响

以葡萄糖氧化酶法测定细胞培养上清液中葡萄糖含量，以无细胞对照组培养液中葡萄糖含量减去各组细胞培养液中葡萄糖含量，即为细胞所消耗的葡萄糖量(GC)；以铜试剂法测定FFAs含量，考马斯亮蓝法测定细胞裂解液蛋白含量，比较各组GC和FFAs溢出量。

结果表明，ANY2可显著增加IR脂肪细胞糖耗量，减少FFAs溢出，与模型组比较差异有统计学意义，见表3。表3化合物ANY2对IR脂肪细胞FFAs溢出及糖耗量的影响(略)

3讨论

前体脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化能力的细胞，它持续存在和作用于动物的一生［3］。前体脂肪细胞的原代培养能保持细胞的生物学特性，便于直接观察各种因素对细胞分化过程的调控机制，是研究脂肪组织的理想模型，也是与脂肪代谢有关的疾病发病机制研究以及相关药物筛选与作用机制研究的重要细胞模型［4］。已建立的来源于鼠前脂肪细胞的细胞株如3T3-L1系列等，在国外应用广泛，但对国内来说，存在着标准细胞株难以得到的问题，而且细胞经过传代后其性状、生物学特性会有一定的改变，与在体实验的联系受到限制。我们对Yu等［5］的方法进行了改良，使用低浓度胰岛素和地塞米松诱导和降低培养液中血清含量等，以此促使细胞自然向脂肪细胞分化，从而建立了大鼠前脂肪细胞的原代培养方法。培养细胞的形态学观察显示，脂肪细胞贴壁后初为类圆形，3d后即可观察到细胞渐成梭形，7d左右细胞增殖明显，形状由多角梭形变为椭圆形，并开始积聚脂肪颗粒。

脂肪细胞的重要功能是储存脂肪；胰岛素抵抗时脂肪细胞即表现为储存脂质能力的下降，甘油三酯分解加快，FFAs过度溢出；而高浓度的FFAs又可引起和加重胰岛素抵抗。两者互为因果，相互影响［6］。

通过结果可以看出，化合物ANY2可显著促进前体脂肪细胞分化，提高细胞储脂能力；1μmol·L-1地塞米松作用于大鼠原代脂肪细胞，可明显减少细胞对培养基中葡萄糖的摄取，FFAs溢出量也大大增加，说明细胞胰岛素抗性已基本形成。化合物ANY2可显著增加细胞糖耗量，减少其因脂解作用释放到上清中FFAs的浓度，同时还增加对胰岛素敏感的小脂肪细胞数目，改善胰岛素抵抗状态，其作用与匹格列酮相当，具有良好的开发潜力。

参考文献

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生物细胞的培养范文篇2

【关键词】双氟胞苷;晶体;上皮细胞;细胞培养技术;兔

【摘要】目的探讨双氟胞苷对培养的兔晶状体上皮细胞(rlecs)体外生长的抑制作用，为临床防治后发性白内障提供理论依据。方法在第3代体外培养rlecs中加入不同浓度双氟胞苷，采用mtt比色法及血细胞板计数法观察不同浓度的双氟胞苷对体外培养的rlecs增殖的抑制作用。结果浓度为64mg/l双氟胞苷在24h对rlecs无明显的抑制作用;浓度为128~4096mg/l的双氟胞苷在24、48、72h对rlecs有明显的抑制作用，与阴性对照组比较差异有统计学意义(f=22.248~34.090，q=2.188~11.353，p<0.05)。在同一作用时间随双氟胞苷浓度的增高，对rlecs的抑制作用逐渐增强，各浓度之间比较差异具有统计学意义(q=2.122~10.524，p<0.05)。各实验浓度的双氟胞苷对rlecs的抑制作用随作用时间延长逐渐增强，在72h抑制作用最强。mtt比色法结果与血细胞板计数法结果一致。结论双氟胞苷可抑制体外培养rlecs的增殖，可用于抑制、预防后发性白内障的形成。

【关键词】双氟胞苷;晶体;上皮细胞;细胞培养技术;兔

[abstract]objectivetostudythedepressanteffectofgemcitabineonthecellsofrabbitepitheliumlentis(rel)invitro,andprovideatheoreticalevidencefortreatmentofaftercataract.methodsthecellsofrelwereculturedinvitro,anddifferentconcentrationsofgemcitabinewereaddedintothecellsofthethirdgeneration.theeffectofgemcitabineatdifferentconcentrationsonthecellswasmeasuredwithmttstainingcolorimetryandcellcounttechnique.resultsthegemcitabineattheconcentrationof64mg/lfor24hdidnotshowinhibitiononcellsofrel(p>0.05);at128-4096mg/lfor24h,48h,and72hshowedobviousinhibition(f=22.248-34.090,q=2.188-11.353,p<0.05),thedifferencesweresignificantascomparedwiththecontrol.underthesame-timecondition,theinhibitoryactionincreasedwiththeincreaseoftheconcentrationofgemci-tabine,thedifferencesamongdifferentconcentrationsweresignificant(q=2.122-10.524,p<0.05).withthesameconcentration,theeffectofprohibitiondependedontime.theresultofmttwasconsistenttothatofcellcounttechnique.conclusiongemcitabinedepressesthegrowthofrelcellsculturedinvitro,whichcanbeusedtoinhibitandpreventsecondarycataract.

[keywords]gemcitabine;lens,crystalline;epithelialcell;cellculturetechnique;rabbits

后发性白内障是白内障囊外摘除术后常见的并发症,也是影响病人术后视力的最主要原因之一，其术后1、3、5年的白内障发生率在成人可以高达11.8%、20.7%、28.5%[1-2]。有关实验的结果表明，术后残留的晶状体上皮细胞的增殖和迁移，转化为成纤维细胞，可能是形成后发性白内障的主要原因之一[3-4]。本实验旨在观察双氟胞苷对培养的兔晶状体上皮细胞(rlecs)体外生长的抑制作用，为临床防治后发性白内障提供理论依据。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物取实验用家兔10只，体质量为1.5～2.5kg，雌雄不限，由青岛大学医学院动物实验中心提供。

1.1.2主要试剂与药品dmem干粉培养基(gibcobrl公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，胰蛋白酶(gibcobrl公司)，四甲基偶氮唑盐(mtt，sigma公司)，双氟胞苷(美国礼莱亚洲公司)，青霉素钠(华北制药有限公司)，硫酸链霉素和硫酸庆大霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1培养液的配制将dmem干粉培养基加入1000ml三蒸水配制成dmem培养液，加入灭活的小牛血清,使之成为含体积分数0.150小牛血清的培养液，4℃冰箱保存。mtt溶液:将mtt474用pbs液溶解，浓度为5mg/l,两层微孔滤膜过滤除菌，4℃避光保存。

1.2.2rlecs的培养实验用兔空气栓塞致死后，完整摘除眼球，在超净工作台内取出晶状体，分离出连着晶状体赤道部的前囊膜。将晶状体前囊膜剪成组织碎片，均匀铺贴于培养瓶底壁，加入培养液置于培养箱中，至细胞游出相互融合，然后进行传代培养。取培养的第3代rlecs，制成细胞悬液，用血细胞板观察四角大方格的细胞数[5-7]。

1.2.3实验分组根据条件培养液的不同，随机分为8组，阴性对照组(无血清培养液)和浓度为64、128、256、512、1024、2048、4096mg/l的双氟胞苷无血清培养液组。

1.2.4rlecs计数①血细胞板计数法[8]：将rlecs悬液调整到细胞密度为2.5×107/l，平行接种到24孔培养板上，每孔1ml，平行3个，放入co2培养箱中10h后取出，弃上清液，8组分别加入条件培养液，置co2培养箱中培养24、48、72h，观察细胞形态学改变。分别于培养24、48、72h后弃去条件培养液，加胰酶消化后，每孔加d-hanks液1ml，将细胞吹打均匀，用血细胞板计数，每孔计数8次，取平均值。②mtt比色法[9-11]：将rlecs悬液调整到细胞密度为5×107/l。平行接种于96孔培养板，平行3个，每板分为9组，每组6孔，第1组为200μl不含细胞的空白对照组，其余8组分别加入200μl上述密度的细胞培养液(含体积分数0.150小牛血清)，每孔细胞数约为5×103个，置co2培养箱中培养。10h后，分别将含有细胞的8组培养液弃去，按实验分组加入条件培养液，置co2培养箱中继续培养。分别于24、48、72h后弃去上清液，每孔再加20μl浓度为5g/l的mtt液，3h后终止培养，弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜(dmso)200μl，在震荡器上震荡30min，使结晶物充分溶解，在全自动酶联免疫检测仪上测定570nm波长处的吸光度(a)值。结果以mtt比色法测定值减去空白对照组测定值表示。

1.2.5统计学处理实验数据以均数±标准差表示，采用spss12.0及ppms1.5[12]软件处理，组间比较采用方差分析。

2结果

2.1正常培养的rlecs形态学观察

组织碎片在接种24~48h后可见细胞游走出植片边缘，贴壁生长，细胞逐渐增多，随时间延长细胞密度增大，最初在靠近植片处，细胞呈团状，3~4d后大部分植片上的细胞游走出植片，围绕植片生长。6~7d细胞生长活跃，10d左右形成围绕植片的单层上皮细胞，铺满瓶底，达到融合状态。原代培养的晶状体上皮细胞呈透明状，多角形或六边形，保持上皮细胞的特征。传代细胞经胰蛋白酶消化后，单个细胞为圆形，6h左右开始贴壁生长，24h后约80%细胞贴壁，细胞增殖迅速，3~4d达到融合。2~4代的晶状体上皮细胞贴壁迅速，增殖快，生长良好，呈展开透明状，排列不规则，与原代细胞无明显差别，传至6代后，细胞贴壁时间延长，晶状体上皮细胞变为成纤维细胞形状，呈长梭形、长条状，细胞大量增殖，中间出现拉网现象。

2.2双氟胞苷对rlecs增殖的影响

2.2.1双氟胞苷对rlecs形态学的影响与阴性对照组比较，浓度为64mg/l的双氟胞苷作用于rlecs24h后，细胞形态无明显差异;浓度为128～4096mg/l时，各实验组的细胞数量逐渐减少，视野中所见细胞稀疏，细胞体积略小，细胞基质较对照组亦减少。随时间的延长，上述现象更加明显，实验组在药物作用48h后，细胞数量进一步减少，细胞收缩呈圆形，细胞基质减少;在药物作用72h后，各实验组的细胞数量及细胞基质较24、48h均明显减少，在4096mg/l组中，视野中偶见小圆形细胞及稀疏的细胞基质。

2.2.2血细胞板计数结果在24h时64mg/l双氟胞苷对晶状体上皮细胞无明显抑制作用，与阴性对照组比较无显著意义(p>0.05)。64mg/l双氟胞苷在48、72h时，128～4096mg/l双氟胞苷在24、48、72h时对晶状体上皮细胞均有明显的抑制作用，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(f=22.248~34.090，q=2.188~11.353，p<0.05)。在同一作用时间内随双氟胞苷浓度的增高，对晶状体上皮细胞的抑制作用逐渐增强，各浓度之间比较差异有显著性(q=2.122~10.524，p<0.05)。各浓度双氟胞苷对晶状体上皮细胞抑制作用，随时间的延长而逐渐增强，从双氟胞苷对晶状体上皮细胞的抑制作用血细胞板计数结果曲线来看，在72h抑制作用最强。见图1。

2.2.3mtt比色法结果在24h时64mg/l双氟胞苷对晶状体上皮细胞无明显抑制作用，与阴性对照组比较无统计学意义(p>0.05)。64mg/l双氟胞苷在48、72h，128～4096mg/l双氟胞苷在24、48、72h对晶状体上皮细胞均有明显的抑制作用，与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(f=42.435~290.688，q=3.133~37.001，p<0.05)。

在同一作用时间内随双氟胞苷浓度的增高，对晶状体上皮细胞的抑制作用逐渐增强，各浓度之间比较差异有显著性(q=2.351~14.298，p<0.05)。从双氟胞苷对晶状体上皮细胞抑制作用mtt比色法a值曲线可以看出，同一浓度双氟胞苷对晶状体上皮细胞的抑制作用在72h作用最强。见图2。图1血细胞板计数法结果曲线图2mtt比色法a曲线

3讨论

近年来，针对后发性白内障的发生机制，许多学者采用多种方法从不同的方向进行研究，尤其是针对抑制残留晶状体上皮细胞增殖的药物研究成为大家关注的热点。白内障术后残留的晶状体上皮细胞在晶状体囊膜上的增生、移行、产生胶原，是白内障摘除人工晶状体植入眼发生后发性白内障的主要原因，晶状体上皮细胞增生移行至后囊可导致后囊混浊的形成[13-14]。

双氟胞苷又称吉西他滨(2，2-二氟脱氧双氟胞嘧啶核苷)，是一种新的胞嘧啶核苷衍生物，主要代谢产物在细胞内参入dna，主要作用于g1/s期。双氟胞苷能抑制核苷酸还原酶，导致细胞内脱氧核苷三磷酸酯减少，尚能抑制脱氧胞嘧啶脱氨酶减少细胞内代谢物的降解，具有自我增效的作用，其对多种肿瘤有效。

本实验主要采用双氟胞苷局部用药的方式，可以减少或消除全身用药的副作用，另外可以提高药物局部的浓度，更好地发挥双氟胞苷对晶状体上皮细胞的作用，为今后进一步体内应用双氟胞苷打下了理论基础。

本实验采用血细胞板计数法及mtt定量法观察了双氟胞苷对晶状体上皮细胞增殖影响，两种方法所得实验结果基本相同，都显示了双氟胞苷在低浓度(64mg/l)对晶状体上皮细胞无明显抑制作用，与阴性对照组比较无统计学意义(p>0.05)，随着双氟胞苷浓度的增高其抑制晶状体上皮细胞增殖的作用逐渐增强，在24、48、72h对晶状体上皮细胞均有明显的抑制作用，与阴性对照组比较，差异有显著性(p<0.05)，说明双氟胞苷对晶状体上皮细胞的抑制作用呈剂量依赖性。从mtt比色法a值曲线可以看出，同一浓度双氟胞苷对晶状体上皮细胞的抑制作用在72h作用最强，呈时间依赖性。

综上所述，双氟胞苷可抑制体外培养rlecs的增殖，并可因此抑制、预防后发性白内障的形成。因人晶状体上皮细胞与rlecs的不同，且体外培养与活体的生理条件有诸多不同，需进一步研究其在人体的作用。双氟胞苷有望成为预防后发性白内障的药物之一。

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生物细胞的培养范文

【摘要】目的应用国家标准推荐的及实验室常用的高压灭菌方法对实验动物塑料饮水瓶进行消毒，观察三种不同消毒方式(温度、时间)消毒后塑料饮水瓶浸出液对L-929细胞生长的影响。方法形态观察法和WST-1法。结果三种消毒方式消毒后，细胞培养基中均未见细菌生长。三种消毒方式下，细胞生长良好，细胞存活率和细胞增殖度均在50%以上。结论根据国家标准进行评价，三种高压灭菌方式对L929细胞形态、生长和增殖有一定程度的影响，其中100℃60min的消毒方式较好，无细胞毒性作用，消毒后的产品具有良好的生物相容性，符合生物材料应用要求。

【关键词】SPF级实验动物设施;细胞毒性;WST-1法

[Abstract]ObjectiveTooptimizethewayofsterilizedrinkingwaterutensilusedinanimalexperimentappliance.MethodsCellmorphologyobservationassayandWST-1assaywereused.ResultsAscomparedwiththecontrol，cellmorphologyandamounthavebeenaffectedbythedifferentsterilizedways.ConclusionAccordingtothenationalcriterionandtheresearchresults，thewaysof100℃60ministhebetterone.

[Keywords]SPFgradeanimaltestappliance;Cytotoxicity;WST-1assay

为保证屏障级实验动物设施环境符合国家标准及保证实验动物和动物实验的质量，所有拟进入实验动物设施内部的物品必须经过一定的灭菌方法处理后才能带入实验设施内。饮水瓶是实验动物设施内动物饮水装备，其消毒灭菌措施一般为高压蒸汽灭菌，国家标准推荐的消毒灭菌温度为121℃维持20min。在实际工作中，发现动物饮水瓶尤其是新塑料饮水瓶在按照上述方式灭菌处理后会有塑料的臭味，虑及其盛装的水被直接饮用进入动物体内，因此要有良好的理化性能和良好的生物相容性。细胞毒性试验是利用体外细胞培养方法来评价生物材料、医疗器材或浸提液成分是否具有潜在的细胞毒性，以其简便、快捷、灵敏性高、节省动物等优点，被列为评价医用器材毒性的重要指标[1，2]。本试验依据中华人民共和国国家标准《医疗生物学评价》(GB/T16886-2003，idtISO10993-5:1992)，分别采用三种常用的消毒灭菌温度对盛装动物饮用水的饮水瓶进行高温蒸汽灭菌，观察灭菌后瓶中的饮用水对小鼠成纤维细胞L-929生长抑制的影响，以评价这三种灭菌条件何者为优，为日常工作提供数据支持。

1材料与方法

1.1主要材料及试剂动物饮水瓶购于中国江苏枫叶实验动物笼具厂。L-929小鼠成纤维细胞株，购自中国科学院上海细胞库，用于实验的细胞传代次数为3~20。高糖DMEM培养基(粉剂)、新生牛血清均购自美国Gibco公司。WST-1细胞增殖试剂盒购自瑞士Roche公司。

1.2实验方法取塑料动物饮水瓶3个，按照每平方厘米内表面积加入10ml动物饮用水的比例分别加入动物饮用水，并盖紧瓶塞。分别采用100℃60min、111℃40min和121℃20min三种灭菌方式处理后，自然冷却至室温备用。

1.2.1细胞毒性试验按照DMEM培养基(干粉)说明书的配制比例，用不同方式灭菌处理后的动物饮用水溶解培养基来配制细胞培养液，调节pH值为7.4，用直径为0.22μm的滤膜过滤后，加入10%新生牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素，4℃储存备用。

1.2.2细胞形态学观察将生长状态良好的L-929小鼠成纤维细胞按3×104/ml的密度接种于6孔板，随机分为4组，分别是对照组、1组(100℃60min组)、2组(111℃40min组)和3组(121℃20min组)，每组3个平行样。细胞在37℃、5%CO2、95%湿度条件下培养24h后，弃去原培养基，溶剂对照组加入新鲜的DMEM培养基，其余各组则加入用相应动物饮用水配制的培养基，置细胞培养箱里继续培养。在细胞培养的第2、4、7天，用光学显微镜对每组细胞进行形态学观察并拍照。

1.2.3测定细胞失贴壁率及细胞活性细胞分组及处理同上，在细胞培养的第2、4、7天，收集各组的培养基，同时用胰蛋白酶消化各组细胞，PBS清洗2次，加入适量新鲜培养基，用血球计数板在显微镜下进行细胞计数，分别计算失贴壁细胞数目及贴壁细胞数目，按下式计算细胞失贴壁率。细胞失贴壁率(%)=失贴壁细胞数目/(失贴壁细胞数目+贴壁细胞数目)×100%细胞按3×104/ml的密度接种于96孔培养板中，每孔体积100μl，细胞分组及处理同上。在细胞培养的第2、4、7天，用WST-1法分析细胞活性，用酶标仪在490nm波长下测定吸光度(OD)值，按下式计算细胞相对增殖度(RGR)。RGR(%)=实验组组细胞OD(490)值/对照组细胞OD(490)值×100%按照RGR值将样品的毒性反应分级如下：0级为RGR≥100;1级为75~99;2级为50~74;3级为25~49;4级为1~24;5级为0。

1.3统计学处理实验计量数据用均值±标准差表示，采用SPSS11.0统计学软件，组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析法，组内差异比较采用Bonferroni法，α=0.05为检验水准。

2结果

2.1各组L-929细胞形态学变化光学显微镜下观察结果可见对照组细胞形态正常，贴壁生长良好，呈梭形或不规则的三角形。在用不同方式灭菌处理后的动物饮用水配制的培养液后第2天及以后，各组细胞贴壁生长仍较为良好，但可见少量的细胞圆缩，偶见悬浮死细胞。(图1)。

2.2各组细胞失贴壁率的变化如表1所示，添加用不同方式灭菌处理后的动物饮用水配制的培养液后第2天，各实验组的细胞失贴壁率与对照组相比，差异无显著性(χ2=1.903，P>0.05)。在第4天，各实验组细胞失贴壁率均升高，与对照组相比差异有非常显著性(χ2=4.262，P

2.3各组L-929细胞活性的变化如表2所示，在添加用不同方式灭菌处理后的动物饮用水配制的培养液第2天、第4天和第7天，实验组细胞活性明显低于对照组，差异均具有非常显著性(第2天，χ2=13.205，P

2.4各组L-929细胞增殖度的变化如表3所示，在添加用不同方式灭菌处理后的动物饮用水配制的培养液第2天、第4天和第7天，实验组细胞增殖度明显低于对照组，差异均具有非常显著性(第2天，χ2=27.172，P

3讨论

体外的细胞毒性实验是用来评价材料对细胞生长状况影响的方法，具有通用性，广泛用于各种器械材料的生物相容性评价。评价的指标一般包括细胞形态学观察、细胞贴壁状况、细胞活性等[2]。L-929细胞是Earle等[3]在1948年从小鼠皮下组织中分离出的成纤维细胞，常用于材料浸提液的细胞毒性实验[4]，并被多部国家标准和卫生部颁发的标准推荐为评价外源性物质细胞毒性首选的细胞[5~7]。为了评价不同方式灭菌处理后的动物饮用瓶的生物安全性，选择小鼠L-929细胞作为受试对象，用添加用不同方式灭菌处理后的动物饮用水配制的培养液培养细胞，观察L-929细胞的毒性反应。本研究结果显示，不同高压消毒方式消毒后，动物饮用水均可使L-929细胞生长形态发生一定程度的改变，细胞变圆，皱缩，细胞失贴壁率明显上升，这些结果均提示这些高压消毒方式均会影响动物饮水瓶的生物相容性，综合比较几种指标可以发现100℃60min的高压消毒方式消毒动物饮水瓶后，动物饮用水的生物相容性与对照组接近，应为较好的高压消毒方式。

(本文彩图见附页2)

【参考文献】

1张伟，唐竹萍，王和玉.笼具塑料的细胞毒性试验.卫生毒理学杂志，1995，9(1)，30-31.

2周颖，朱伟，张全新WST-1细胞增殖试剂在抗肿瘤药物筛选中的应用.热带医学杂志，2005，5(5)580-582.

3医疗生物学评价.GB/T16886.5-2003.

4李延斌，逢天秋.人工肾的最新进展及临床应用.中国医疗器械信息，2003，9(1):13-18.

5芮海荣，赵养俊，林为民.高通量透析器用于血液透析对MHD患者血P及PTH的影响.第四军医大学学报，2005，26(7):664.

生物细胞的培养范文篇4

一、分子水平的克隆—PCR技术

该科技技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。

PCR由三个基本反应步骤：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解旋，使之成为单链，以便它与引物结合;②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

二、细胞水平的克隆—动物细胞培养技术

动物细胞培养是用酶解法将组织碎块分离成单个细胞，用培养液制成细胞悬浮液，在体外适宜条件下使细胞生长繁殖，并保留一定的结构和功能特性。

(一)细胞培养所需的条件

1.培养液

现多用合成培养液。合成培养液有多种，不同培养液适用于不同细胞。可根据培养细胞的特殊要求进行添加：抗生素、有机补充物(如丙酮酸钠，谷胺酰氨等)、促细胞分裂因子(生长因子类的FGF等)、贴壁和铺展因子(如胶原蛋白，纤粘蛋白等)。

2.血清

在细胞培养液中必须添加一定量的血清方能获得成功。血清中除了含有细胞生长的部分氨基酸外，还有促进细胞生长和贴壁的成分。不同动物血清的作用差别很大，即使同一种动物的不同个体间的差异也很显著。不同种细胞要求血清量也不同，大部分细胞生长液中加入10%血清已可满足细胞生长要求。目前国内外正在研制无血清培养液，以避免血清中某些物质对细胞生长和病毒复制的影响。

3.PH

细胞生长的PH为6.6-7.8，但最适PH7.0-7.4。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐、磷酸氢盐和血清。

4.温度

细胞培养的最适宜温度应与细胞来源的动物体温一致。

此外，成功的细胞培养还需要严格的无菌操作及洁净的培养器皿。

(二)细胞生长的三个阶段

1.潜伏期

细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。

2.指数生长期

指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。

3.停滞期

即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。

(三)动物细胞的培养

1.原代细胞(primarycell)

动物组

织经胰蛋白酶等消化、分散、获得单个细胞，在培养皿中大多数组织均可制备原代细胞，但生长的快慢及难易程度不一。原代细胞一般对病毒较易感染，尤其是来源于胚胎或幼畜组织的细胞。

2.二倍体细胞株(diploidcellstrain)

将长成的原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其细胞染色体数与原代细胞一样，仍为二倍体。此种细胞数量可扩大，对病毒的易感性则基本无变化。

3.传代细胞系(establishellcellline)

与上述两类细胞不同，这类细胞在传代过程中染色体发生异常变异，在体外可无限制分裂。

三、个体水平的克隆—动物细胞核移植技术

所谓细胞核移植技术，就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。

(一)供体核的获得

供体核可以是早期胚胎细胞、胚胎干细胞和体细胞。早期都采用合子核到64细胞期的胚胎细胞核质体分裂球作供体细胞核，80年代开始，随着胚胎干细胞(embryostemcells，ES)的建立和对其研究的深入，人们对胚胎干细胞在核移植方面的应用前景寄予厚望，但ES建系太困难，仅在小鼠上获得成功。1997年Dolly羊的出现，开始了体细胞的核移植，并发展很快。

(二)受体细胞去核

作为细胞核移植的受体细胞主要有三类：去核的卵母细胞、受精卵和2-细胞胚胎，其中卵母细胞应用最为广泛。研究证明，体外成熟培养的卵母细胞核移植成功率不如体内成熟的卵母细胞，其原因可能是卵母细胞在体外成熟过程中，需要合成一些蛋白质来完成第一次减数分裂，其活动有可能受到抑制。

(三)核卵重组

在显微操作仪操纵下，用一直径接近卵裂球大的移植针吸取一枚分离出的完整卵裂球，注入去核的受体卵母细胞的间隙中，根据移入的部位不同，可分为带下移植和细胞质内注射。在移植针移开后，对移植卵裂球上方的透明带施加压力使卵裂球与卵母细胞接触。

(四)细胞融合与激活

由于卵细胞去核过程中破坏了卵膜和一部分细胞质，若直接移植，成功率很低，故需对重组胚融合，其采用的方法有仙台病毒法、物理或化学方法(如电融合法、钙离子载体、乙醇、蛋白质酶合成抑制剂等)激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育过程，电融合法更常用。

(五)重构胚培养与移植

重构胚需一定时间的培养，方可移植到受体，家兔和猪重构胚在体外培养24h以内，就可通过非手术移植，而羊和牛重构胚所需培养时间较长，一般发育到囊胚或桑椹胚时移植。

生物细胞的培养范文篇5

［目的］研究二去水卫矛醇对人卵巢癌细胞A2780和SKOV3增殖的抑制作用。［方法］采用噻唑蓝（MTT）比色法和CCK－8（cellcountingkit－8）法检测不同浓度DAG对人卵巢癌细胞A2780和SKOV3的体外抑制作用，观察DAG的半数抑制浓度。［结果］MTT法检测结果显示，DAG对人卵巢癌细胞A2780、SKOV3作用72h后半数抑制浓度（72h－IC50）分别为19．97μg／ml、22．57μg／ml；而CCK－8法检测结果显示，DAG对人卵巢癌细胞A2780、SKOV3作用72h后72h－IC50分别为15．15μg／ml、16．15μg／ml。显微镜下可见DAG72h作用后细胞圆缩、胞质浓缩、胞浆内颗粒集中边缘化甚至细胞溶解等损伤现象。［结论］DAG在体外对人卵巢癌细胞A2780和SKOV3均有抑制生长作用。

关键词：

二去水卫矛醇；人卵巢癌细胞；噻唑蓝试验；CCK－8法；半数抑制浓度

二去水卫矛醇是以从卫矛科植物蜜花美登木中分离出的卫矛醇［1］为原料，经溴化、消除反应而制得的1，6－二溴卫矛醇（1，6－dibromidulcitol）的双环氧化物，是新型的植物生物碱类抗肿瘤药，它与烷化剂形成交叉耐药，结构上可归为烷化剂类，为广谱抗肿瘤药物，具有毒性小、易溶于水、抗肿瘤活性高等优点。早期临床试验表明，DAG对慢性粒细胞白血病、肺癌、原发性脑瘤、人胃癌细胞、人鼻咽癌细胞、人肺癌细胞、肾上腺肿瘤、膀胱癌、胃肠道肿瘤实体瘤等均有抑制作用［2－7］。另外，还有研究表明DAG是周期非特异性药物，它可以与某些周期特异性药产生协同作用［8］。而DAG对人卵巢癌抑制作用及分子机制的研究在国内外尚未见详尽报道。为此，本实验通过噻唑蓝（MTT）比色法和CCK－8法检测DAG对人卵巢癌的体外抗肿瘤活性，为扩大其抗瘤谱及进一步进行结构改造、分子机制研究提供依据。

1材料与方法

1．1药物与细胞株二去水卫矛醇由广西梧州制药（集团）股份有限公司提供，临用前用完全培养基液配成所需浓度；RPMI1640、胎牛血清（FBS）、0．25％胰蛋白酶溶液均购于赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS，0．01mol／L）是福州迈新生物技术开发有限公司产品；青链霉素混合液（100U／ml）和噻唑蓝（MTT）均是北京索莱宝科技有限公司产品；CCK－8溶液是上海尚宝科技有限公司产品；人卵巢癌细胞A2780和SKOV3购自中科院上海细胞库。

1．2主要仪器设备CO2培养箱；酶标仪；倒置显微镜（重庆光学仪器厂出品）。

1．3细胞的培养先配好含10％胎牛血清和青链霉素混合液（终浓度为青霉素100IU／ml，链霉素100μg／ml）的RPMI1640完全培养液，然后用此完全培养液于37℃、5％CO2培养箱中培养人卵巢癌细胞A2780和SKOV3，细胞贴壁生长，隔天换液，待细胞长至覆盖瓶底的80％左右时，用0．25％胰蛋白酶溶液消化传代。取状态良好的长至对数生长期的细胞用于后续细胞增殖抑制实验。

1．4MTT试验方法收集对数生长期的A2780和SKOV3细胞，调整细胞密度，以每孔100μl、5×103个细胞接种于96孔板里，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，以细胞培养基为空白对照，A2780、SKOV3细胞的其他组分别加入6μg／ml、12μg／ml、24μg／ml、48μg／ml、96μg／mlDAG完全培养液100μl，同时每组设5个复孔，处理完后置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养72h后，倒置显微镜下观察细胞形态，并于每孔中加入20μl的MTT溶液，放入CO2培养箱中继续培养4h，弃去培养液，每孔加入150μlDMSO溶液显色，振荡10min，使孔内溶液颜色均匀，于570nm波长酶标仪测定吸光度值（OD）。实验重复3次，取平均值为最终结果。按下式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率＝1－实验组平均OD值／空白对照组平均OD值×100％，计算细胞生长抑制达50％的DAG浓度，以72h－IC50表示。

1．5CCK－8试验方法细胞处理情况与MTT法相似，待培养细胞，给药处理72h后，同样于倒置显微镜下观察细胞形态，将每孔培养液混合均匀，吸出100μl弃去，并于每孔中加入10μl的CCK－8溶液，放入CO2培养箱中继续培养，待1．5h后观察显色情况，于450nm波长酶标仪测定吸光度值（OD）。实验重复3次，取平均值为最终结果，计算细胞增殖抑制率。

2结果与分析

2．1两种方法测定结果MTT法测定不同浓度DAG对A2780及SKOV3细胞作用72h后的OD值及细胞增殖抑制率见表1，CCK－8法测定不同浓度DAG对A2780及SKOV3细胞作用72h后的OD值及细胞增殖抑制率见表2。通过SPSS19．0软件计算DAG对两种细胞的半数抑制浓度（IC50）值。表1、表2结果看出，经不同浓度DAG作用72h后，上述实验组的OD值与空白对照组相比均呈下降趋势，且有明显的浓度－效应关系。说明DAG对以上两株人卵巢癌细胞均有抑制生长作用。两种测定方法的结果显示，CCK－8法的灵敏度和准确度较高，且重复性优于MTT法。

2．2细胞形态观察结果DAG作用于A2780和SKOV3细胞72h后，在倒置显微镜下观察，各实验组细胞均不同程度出现贴壁能力减弱、细胞圆缩、胞质浓缩、胞浆内颗粒集中边缘化甚至细胞溶解等损伤现象，而空白对照组细胞均生长良好，细胞形态完整，胞质透亮。

3结论

生物细胞的培养范文篇6

■一、植物组织培养的原理、基本过程及应用

1.原理：细胞全能性。

2.基本过程：外植体愈伤组织胚状体新植物体。

将已消毒的材料，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，切成小片制成外植体；外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织；这些细胞继续分裂和分化形成胚状体，最后生长成为一株新植物体。整个过程要确保无菌条件，并调节温度、营养、激素等因素以满足植物组织培养的需要。

3.应用：

植物组织培养技术已广泛应用于快速繁殖某些稀有植物或有较大经济价值的植物；使用组织培养法获得脱毒苗已经在草莓、葡萄、康乃馨等获得成功，产生了明显的经济效应；人们还利用植物组织培养技术进行植物种质资源的保存、挽救濒临灭绝的植物；甚至，通过花药和花粉培养获得单倍体植株、缩短育种年限。

■例1紫草素是紫草细胞的代谢产物，可作为生产治疗烫伤药物的原料。用植物组织培养技术可以在生物反应器中通过培养紫草细胞生产紫草素。下图记录了生物反应器中紫草细胞产量、紫草素产量随培养时间发生的变化。

（1）在生产前，需先加入紫草细胞作为反应器中的“种子”。这些“种子”是应用组织培养技术，将紫草叶肉细胞经过_________而获得的。这项技术的理论基础是__________。

（2）从图中可以看出：反应器中紫草细胞的生长呈现____________规律；影响紫草素产量的因素是__________和___________。

（3）在培养过程中，要不断通入无菌空气并进行搅拌的目的是__________________和___________________________。

■解析由于紫草素是从大量培养的紫草愈伤组织细胞中提取的，所以生产前无需对离体的紫草细胞进行脱分化，从而获得大量的紫草愈伤组织细胞，这一培养过程利用了植物细胞的全能性。从图中可以看出，反应器中紫草细胞的数量呈“S”型增长，因为紫草细胞开始生长较慢，要经过适应期进入稳定期，细胞的数目才能相对稳定，在该时期紫草细胞产生大量次级代谢产物紫草素，所以紫草素产量的高低与紫草愈伤组织细胞的数目和生长期密切相关。在生产实践中，获得细胞代谢产物是植物组织培养技术的重要应用。

■答案（1）脱分化（或脱分化形成愈伤组织）细胞的全能性

（2）S型增长细胞数量细胞所处的生长期

（3）保证氧气供应充足使细胞与培养液充分接触

■二、影响植物组织培养的因素

1.外植体的选取：生长旺盛的嫩枝等，生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。

2.培养基：

（1）配制：要严格灭菌，并进行无菌操作。

（2）营养：矿质元素和有机物。

（3）调节剂：生长素、细胞分裂素（注意两者比例）。

3.环境条件：温度、pH、光照等。

■例2在的组织培养操作完成了3~4d后，观察同一温室中的外植体，发现有的瓶内的外植体正常生长，有的瓶内的外植体死亡，你认为外植体死亡的原因不可能是（）

A.接种培养基灭菌不彻底

B.接种工具灼烧后未待冷却就接种外植体

C.愈伤组织形成初期没有给予充足的光照

D.培养过程中保持温度、pH的适宜，但没有及时调整各种营养物质、激素的比例

■解析因为植物组织培养利用的植物材料体积小、抗性差，所以对培养基的要求较高。用于植物组织培养的培养基也能用于某些微生物的培养，如细菌和真菌，但培养基一旦受到微生物的污染，就不再适合植物组织培养，因此要进行严格的无菌操作。培养的不同阶段，植物对营养物质和激素水平的需求有所差异，所以要及时调整各种营养物质的比例。愈伤组织形成过程中，细胞还没有开始再分化，未形成叶绿素和叶绿体，不具备光合作用的结构，因此愈伤组织形成初期不需要光照。

■答案C

■三、植物激素在组织培养过程中的重要作用

生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素，其作用及特点见下表。

■例3植物甲、乙是两种濒危药用植物（二倍体）。请按要求回答问题：

（1）以植物甲、乙的茎尖和叶片为材料，通过组织培养获得了再生植物，解决了自然繁殖率低的问题。这表明植物细胞具有____________。由叶片等材料形成的愈伤组织的形态结构特点是________________。

（2）图1和图2分别是植物甲、乙的萌发花粉粒和未受精胚珠的示意图。

在分离胚珠细胞的原生质时，通常使用纤维素酶和果胶酶破坏细胞壁。其原理是利用了酶的________（性质）。如果将图1中的1个与图2中的1个_______细胞或2个_______融合，可培育出三倍体植株。用适当浓度的秋水仙素处理该三倍体植株的幼苗，能获得药用成分较高的六倍体植株。秋水仙素的作用机理是_______________。

（3）植物乙自然结实率低，主要原因是花粉粒萌发后多数花粉管不能伸长。为探究生长素对植物乙花粉管伸长的影响，某生物兴趣小组进行了课外实验，得到下表结果：

请结合表中数据对实验结果进行简要分析：___________________________。

根据上述分析，可以得出的结论是：____________________________________。

■答案（1）全能性排列疏松无规则，高度液泡化而无定形状态的薄壁细胞（2）专一性珠被极核抑制纺锤体的形成，导致染色体不分离而发生染色体数目加倍（3）生长素在一定的范围内，随着生长素浓度的增加，对花粉管萌发的促进作用逐渐加强，超过一定的浓度后，随着生长素浓度的增加，对花粉管萌发的抑制作用逐渐加强低浓度生长素促进花粉管的萌发，高浓度的生长素抑制花粉管的萌发

■巩固训练

1.（多选）明党参是我国珍稀药用植物，对其进行保护性开发利用的方法有（）

A.设计细胞培养反应器，实现药用成分的工厂化生产

B.大量培养愈伤组织，直接提取药用成分

C.大规模栽培组织培养苗，获取药用成分

D.利用组织培养获得胚状体，制成人工种子

2.人工种子是人们模仿天然种子的结构造出来的生命有机体，它能像天然种子一样萌发生长。人工种子的核心部分是被外层物包埋的具有类似种子胚功能的胚状体，胚状体不同于一般种子的胚，它是由非合子细胞分化形成的类似于胚的结构物，所以又称“体细胞胚”、“花粉胚”。胚状体可从悬浮培养的单细胞中得到，也可以通过试管培养的茎尖、芽尖、子房、花粉等获得。将胚状体包埋在一个能提供营养的胶质中，便制成了所谓的“人工种子”。其培育过程如下图所示：

请根据以上材料回答：

（1）人工种子依据的原理是_________，经过______________技术培育而成的。

（2）包埋胚状体的胶质可以看作是种子的哪部分结构？_____________________。

（3）某二倍体植物基因型是DdTt，利用这种生物技术采用花药离体培养的方法，可培育成“花粉胚”，也可制成人工种子，这种种子萌发形成的个体为_____________，基因型________。

（4）如果外植体为植物的茎尖，通过①的处理可使细胞彼此分离，可加入_______。

A.15%的盐酸B.淀粉酶

C.果胶酶D.胰蛋白酶

（5）②表示脱分化过程，其实质是____

______________；③表示再分化过程，其实质是_________________

________________。

（6）从上面所述胚状体的类型分析，人工种子萌发长成的植株是否可育？________

___________________

__________________。

3.右图为植物体细胞杂交过程示意图。据图回答：

（1）步骤①是___

__________________，最常用的方法是_____

_____________。

（2）步骤③一般常用的化学试剂是____________，目的是_________________。

（3）在利用杂种细胞培育成为杂种植株的过程中，运用的技术手段是__________，其中步骤④相当于__________，步骤⑤相当于_____________。

（4）植物体细胞杂交的目的是获得新的杂种植株。使___________________________

能够在新的植物体上有所表现，其根本原因是________________________。

（5）若远源杂交亲本A和B都是二倍体，则杂种植物为_____倍体。

（6）从理论上讲，杂种植株的育性为_______。若运用传统有性杂交方法能否实现？______，原因是_____________________。因此，这项研究对于培养作物新品种方面的重大意义在于_______________________。

（7）利用植物体细胞杂交的方法培育作物新品种过程中，遗传物质的传递是否遵循孟德尔的遗传规律？为什么？

__________________________________________________________。

4.请回答：

（1）植物微型繁殖技术属于植物组织培养的范畴。该技术可以保持品种的，繁殖种苗的速度。离体的叶肉细胞在适宜的条件下培养，最终能够形成完整的植株，说明该叶肉细胞具有该植物的全部__________________。

（2）把试管苗转接到新的培养基上时，需要在超净工作台上进行，其原因是避免的

_______________污染。

（3）微型繁殖过程中，适宜浓度的生长素单独使用可诱导试管苗_______________，而_________与_________配比适宜时可促进芽的增殖。若要抑制试管苗的生长，促使愈伤组织产生和生长，需要使用的生长调节剂是（脱落酸、2，4-D）。

（4）将某植物试管苗培养在含不同浓度蔗糖的培养基上一段时间后，单株鲜重和光合作用强度的变化如图。据图分析，随着培养基中蔗糖浓度的增加，光合作用强度的变化趋势是_____________，单株鲜重的变化趋势是_____________。据图判断，培养基中不含蔗糖时，试管苗光合作用产生的有机物的量______（能、不能）满足自身最佳生长的需要。

（5）据图推测，若要在诱导试管苗生根的过程中提高其光合作用能力，应_________（降低，增加）培养基中蔗糖浓度，以便提高试管苗的自养能力。

■参考答案

1.ABCD

2.（1）细胞的全能性植物组织培养

（2）种皮及提供营养的胚乳或子叶（3）单倍体DT、Dt、dT、dt（4）C（5）使细胞恢复分裂基因的选择性表达，导致了细胞形态、结构和功能的改变（6）若是由花粉（或三倍体植物的营养器官）发育而来的则不可育；若是由茎尖、根尖等营养器官发育而来的则可育

3.（1）去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体酶解法（2）PEG诱导不同植物体细胞的原生质体融合（3）植物组织培养脱分化再分化（4）远源杂交亲本的遗传特征杂种植株获得双亲的遗传物质

生物细胞的培养范文

关键词：创新；细胞生物学；科研；实践；教学

中图分类号：G642.0文献标志码：A文章编号：1674-9324（2015）29-0114-02

培养创新型人才，努力提高大学生的创新意识和创新能力，是增强学生综合素质的需要，也是一个民族进步和国家兴旺发达的不竭动力。作为生命科学的基础和前沿学科，《细胞生物学》是一门实践性、研究性很强的课程，内容比较抽象、深奥，需要理论和实践密切联系。

传统的教学方式是以教师、教材和课堂三者为中心的封闭式教育模式，教师在课堂上单向灌输知识，学生被动地接受。在这种模式下，大学生主要的学习活动是通过死记硬背记住教材现成结论、机械地接收实验技能，不利于学生发散性思维和自主学习能力的培养。另一方面，传统教学中理论和实践教学与科研相脱节。高等学校教学与科研是相互依赖、相互促进、不可分离的一体；教学是科研的基础，科研是教学的发展和提高。没有科研的支撑，难以实现旨在培养创新能力的教学目的。但由于实验设施等条件的限制，本科生参与科研项目的机会较少，不利于综合素质的培养。针对传统教育模式存在的问题，核心主干课程《细胞生物学》的理论和实践教学模式改革就显得十分必要。

一、采用多样化的教学方法突出学生学习的主体性

为了进一步适应当前对高层次专业复合型人才的需求，培养具有系统理论知识和分析解决问题能力的创新人才，我们在理论课的教学模式中推行启发式、研究式、讨论式、基于问题式等教学手段，以学生为中心代替了以教师为中心，以重能力培养代替传统重知识传授，以小组讨论和教师指导式教学方法代替了传统的课堂讲授，使学生更加积极、主动参与教学活动，真正实现“互动式教学”。并且在保证基础知识教学的前提下，将教学活动与科研、实践工作紧密而有机地结合，以科研、实践引导和促进教学，提高学生自主学习和独立思考以及分析问题和解决问题的能力。通过丰富多样的教学方式为学生创造实践机会，激发兴趣使学生不由自主地进入研究性学习，从而使教师从知识的传输者变为指导者和促进者，学生从知识的被动接受者变为知识的主动构建者。这种以学生为主体，强调理论联系实际的教学形式，促进了学生创新教育和素质教育水平的提高。

（一）基于问题的启发式教学模式

以问题为基础的教学方法是以学生为中心、以教师为引导的开放式教学方法，是将问题作为教学的基本因素，教师在授课时有计划、有步骤地向学生提出问题，学生或者带着问题听课，或者课后根据问题进行思考，使学生在不断的提出问题和解决问题中完成教学内容的学习，找到问题的答案。这种基于问题式的教学方法，鼓励学生提出更好的问题，在探索和思考中学习，可以培养学生分析问题和解决问题的综合能力，养成终生独立学习的习惯。

（二）讨论式教学模式

细胞是一切生命体生长、发育、衰老和死亡过程的基础，从遗传到变异，从生理到病理，几乎所有生命现象的原因都要到细胞中寻找答案。近年来，现代细胞生物学领域中的重大进展非常精彩，许多研究内容和成果如细胞通讯、细胞增殖及其调控、细胞衰老与程序化死亡等对社会的发展影响深远。为了提高学生对课程学习的兴趣，我们增设了4个学时的讨论课。讨论课由教师给定一些议题，如“细胞信号传导与环境适应性讨论”、“光合作用研究与人类未来面临的粮食问题讨论”、“细胞生物学的最新研究成果与诺贝尔生理医学奖”、“细胞学发展历程对‘三观’的启示”、“猎奇与兴趣在细胞生物学发展中的意义”、“人造生命――克隆人与生物伦理学”等。讨论分组进行，每个小组负责一个题目的全面阐述，小组成员分工协作完成查阅文献、制作ppt和课堂报告等工作，然后由教师做出评价。通过讨论式教学可以激发学生学习的兴趣和积极性，锻炼学生口头表达能力，并培养团队合作精神。

（三）研究探索式教学模式

细胞生物学中很多重大的理论和结果都是建立在经典实验基础之上的，教材中具有丰富的实验素材。在教学中，我们注重讲解实验的设计和过程，分析、总结和归纳实验背后的原理，启发学生对科学问题及重大发现的认识和思考。课外鼓励有兴趣的学生参与到教师的植物组培科研项目中，完成一些能胜任的实验环节，将科研中的问题带入课堂，引导学生思考和讨论，在应用、实践和错误中学习，加深学生对基本理论的理解。开展研究式和探索式的教学模式，可以使学生在“学习基础理论知识―联系实际应用―巩固再提高”的探究实践中，逐步培养出科学的思维方式和严谨的科学态度。

二、发挥教师的主导作用培养学生的创新能力

在高校中，科研训练是培养创新人才和提高大学生创新能力的重要方法和有效手段。通过科研训练，让大学生系统地参与到科研项目当中，让学生“做中学”，将理论知识应用到实践，锻炼动手能力，达到学以致用、活学活用的目的。在科研和实践方面，我们充分发挥教师的主导作用，各位老师在获得科研项目的基础上，创造多种有利条件鼓励有兴趣、有能力的学生较早地参与教师的科研课题，并引导学生积极参与大学生创新创业训练计划和课外学术竞赛等一系列科技创新活动中。在专业教师指导下，学生自行查阅文献，自主设计实验并完成实验内容，最后整理实验数据、分析实验结果，进而撰写成。科研活动使学生学习了科研的知识，通过收集、整合信息构建知识，体会到科研的乐趣，进而增强了大学生的动手能力和创新意识，取得了较好的成果。利用科研大平台将理论和实践相结合，教学与科研相辅相成，这样就形成了覆盖课堂内外的立体化教学模式，将学生的专业知识、创新能力和科研素质的提高紧密结合起来，达到了培养本科生工程实践创新能力的教学目的，同时也可使学生尽早了解教师的研究方向和内容，有利于大四毕业论文等环节的完成。近几年来，学生参与数量上以及考研升学人数、比例层次都得到稳步提高，考入上海交通大学、南京大学等名校研究生的学生比例逐年增加。

三、改革课程考试方式推进教学改革效果

传统考试制度存在诸多弊端，如考核方式单一、考试内容单一，这种片面的评分方法不能真实反映学生理解知识和应用知识的能力，也很难达到理论与科研实践相结合，提高学生创新能力的教学目的。为了更全面、科学、客观地评价学生的综合能力，我们将期末一卷定成绩的传统单一考试方式改革为多元化的综合考核方式，进而带动教学模式的改革。学生成绩的评定由平时成绩和期末考试两部分组成，平时成绩的比例增加到30%。平时成绩主要包括课堂考勤、课堂测试、课后作业、期中考试以及专题讨论等。课堂小测试我们采用2人一组，让学生自主设计考题；或者采用试题抽签、一人一题的方式，专题讨论分组进行。期末考试主要考察学生对基础知识，包括基本概念、原理和方法的掌握情况，以及对应用实例的理解，同时也增加了综合分析题及实验技能等试题。通过课程考核方式的改革，既调动了学生在课堂上的积极性，也建立了一个真正全面、客观、合理的课程考核体系，效果良好。

四、结语

高等教育的发展方向是以学生为主体，重视能力培养，促进大学生的全面发展。在近年来的教学改革实践中，我们遵循能力本位的理念，基础与科研实践并重，探索了一条立足课程体系优化和完善、科研创新实践为目标的人才培养模式。通过互动式、实践性教学引导学生进行探究性学习，激发学生自主学习的兴趣，从而达到培养学生创新和科研能力的目的。在课堂教学过程中，我们以细胞生物学的经典实验为例，引导和培养学生进行创新性思维；并通过讨论课等形式，调动学生学习的积极性；同时课外鼓励那些对科研具有浓厚兴趣的学生，进一步进行系统的科研创新能力培养。因此，教学与科研实践相结合的教学模式，可以帮助学生更好地构建细胞生物学的知识体系，对于培养学生的创新思维意识和研究能力，培养具有可持续发展能力的应用型生命科学人才均具有重要意义。

参考文献：

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[3]熊德慧，胡维新.开放式教学法在分子生物学教学中的实践[J].湘南学院学报，2006，（3）.

[4]吴学玲，刘新星，周洪波，等.细胞生物学研究性学习模式的探索和实践[J].中国科技信息，2008，（9）.

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[7]方瑾，于敏，张惠丹，等.构建多元化的细胞生物学PBL教学模式[J].中国细胞生物学学报，2013，35（1）.

生物细胞的培养范文1篇8

【摘要】目的探讨去甲硫氨酸（Met）环境是否提高化疗药物对胃癌细胞的杀伤作用。方法将30例新鲜人胃癌组织制成单细胞悬液，分别培养于Met-Hcy+和Met+Hcy-培养基中，并在不同培养基中分别加入5-FU、DDP化疗药物，用MTT比色法检测各组细胞的抑制程度。结果Met-Hcy+培养基分别与5-FU、DDP联合时，可显著提高化疗药物对胃癌细胞的杀伤作用。结论Met-Hcy+培养基联合各化疗药物，可提高对胃癌细胞的杀伤作用。

【关键词】甲硫氨酸依赖；胃癌原代细胞；化疗

【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofmethioninedependenceincombinationwithchemotherapeuticalagentsonhumanprimarygastriccancercells.Methods30freshgastriccancersamplesweremanagedtosinglecellsuspensionsandthenwereculturedinMet-Hcy+andMet+Hcy-mediumseparately，then5-FU，DDPwereadded，theinhibitionrateoftumorcellsindifferentculturemediawasexaminedbymicrocytotoxicity(MTT)assay.ResultsMethioninedependenceincombinationwithchemotherapyenhancedobviouslythekillingcapacityofeachchemotherapeuticalagentsonhumanprimarygastriccancercells.ConclusionThecombinedapplicationofMet-Hcy+mediumanddifferentchemotherapeuticalagentscouldenhancetheantitumoreffectofchemotherapyonhumanprimarygastriccancercells.

【Keywords】methioninedependence；primarygastriccancercells；chemotherapy

近年来的研究发现，某些肿瘤细胞在用甲硫氨酸（Methionine，Met)前体——同型半胱氨酸替代Met的培养基中生长受阻，而正常细胞生长良好，提示肿瘤细胞的生长具有依赖Met的特性［1］。当Met依赖性的肿瘤细胞处于Met饥饿状态时，再加上周期特异性化疗药物，可望获得较好的抑制肿瘤细胞增殖的效果。本研究将人胃癌原代细胞置于Met-Hcy+和Met+Hcy-培养基中，并在不同培养基中分别加入5-FU、DDP化疗药物，观察胃癌细胞的存活率和判断去甲硫氨酸（Met）环境能否提高化疗药物对胃癌细胞的杀伤作用。

1资料与方法

1.1一般资料人胃癌原代细胞取自入住本院外科的进展期胃癌病人的胃癌组织，共30例，其中腺癌28例，黏液癌2例。

1.2细胞培养和MTT测试

1.2.1标本采取和制备手术时，胃癌标本一经离断，立即在无菌操作下采取胃癌组织，用机械法制成单细胞悬液，调整细胞浓度为2×105/ml。

1.2.2培养基以不含Met的RPMI-1640培养液（GIBCO公司）和已透析小牛血清（GIBCO公司）为基础，配制成不含Met但含有同型半胱氨酸（Hcy）的Met-Hcy+培养液和含Met但不含Hcy的Met+Hcy-培养液，见表1。

1.2.3化疗药物溶液配制分别以Met-Hcy+培养基和Met+Hcy-培养基为基础配制5-FU和DDP药物溶液，其中，5-FU溶液的浓度为20μg/ml，DDP溶液的浓度为6μg/ml，均为与细胞接触的终浓度的2倍。

1.2.4接种将每例胃癌原代细胞接种于96孔板上，100μl/孔。再分别加入以Met-Hcy+培养液和Met+Hcy-培养液为基础、分别含有5-FU（20μg/ml）、DDP（6μg/ml)的溶液，100μl/孔，使每孔总液量达到200μl。与细胞接触的5-FU终浓度为10μg/ml（10μg/ml为体内血峰浓度)；DDP终浓度为3μg/ml（3μg/ml为体内血峰浓度)。每种药物组设3个复孔。不加化疗药物组为对照组。

1.2.5培养将各组细胞置于37℃、含5%CO2的细胞培养箱中，培养48h后，每孔加5mg/ml四唑蓝（TetrazoliumSalt)2μl，4h后，加入10%酸化十二烷基硫酸钠溶液（含10%异丁醇）100μl，培养过夜。

1.2.6MTT法测试用自动酶标仪（318—MicroplateReader)比色，波长492nm，得到每孔的光密度值（OD），每组取3孔的平均值，表示该组活细胞的数量。

1.3统计学方法用配对t检验比较同一药物、同一肿瘤细胞在不同培养基中生长的受抑程度。以P

2结果

不同培养基联合化疗药物对人胃癌原代细胞生长的影响。5-FU、DDP分别加入Met-Hcy+培养基和Met+Hcy-培养基后，上述化疗药物中的无论哪一种加入Met-Hcy+后，其对胃癌细胞生长的抑制作用都较加入Met+Hcy-的各组为显著（P

3讨论

化疗在恶性肿瘤治疗过程中具有不可替代的地位。化疗成功与否，对病人的生存期和生活质量具有重要影响。胃肠道肿瘤多属化疗中等敏感的恶性肿瘤，目前临床应用的经验性化疗方案缓解率仅为30%左右，大多仅能达部分缓解，而且由于肿瘤细胞异质性及多重耐药性等因素存在，使化疗效果并不理想。通过抗肿瘤药物敏感性检测，前瞻性地提出个体化化疗方案，以指导临床治疗，对提高疗效、避免不必要的毒副作用及防止肿瘤多重耐药性的发生有重要意义。

自1974年Timofeyresky在光学显微镜下观察抗癌药物对白血病细胞形态的影响以来，化疗药物敏感性检测得到了迅速发展。1971年，Park首创人肿瘤细胞集落形成药敏测试法（HTCA法），随后，其他学者又相互建立了同位素渗入法（3H-TdR法）、四唑蓝快速比色法（MTT法）、区别染色细胞毒法（Disc法）、三磷酸腺苷生物法（TAP-CSA法）和琥珀酸脱氢酶抑制试验（SDI-T法）等。MTT法利用活细胞线粒体脱氢酶能将可溶性MTT转化为蓝色衍生物亚臜（formazan)的原理，通过自动酶标仪计数来检测活细胞数量，从而评价肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

当前临床上常规使用的化疗药物，还难以完全杀灭肿瘤细胞，采用某些措施进一步提高化疗药物疗效，是抗肿瘤治疗的目标之一。从理论上说，细胞群体中处于增殖期的细胞越多，则该群体受细胞周期特异性化疗药物的作用越大。因此，促使G0期肿瘤细胞进入增值周期是提高肿瘤化疗疗效的一种新的尝试途径。甲硫氨酸（Met)是一种含硫氨基酸，系S-腺苷甲硫氨酸的前体，后者是甲基易位时的主要提供者，各种恶性肿瘤细胞在缺乏Met时，其代谢和增殖均受到抑制。国内外多年的研究表明［1］，Met饥饿可使大部分肿瘤细胞停滞于S期和G2M期，这就为临床上应用Met饥饿+周期特异性化疗，更有效地提高化疗药物疗效提供了一条新途径。

众多学者研究证实［2，3］，将Met--TPN分别与5-FU、DDP等药物连用时，能显著提高胃癌、乳癌等肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本研究结果表明：5-FU、DDP与Met-Hcy+培养基连用，对胃癌细胞生长的抑制作用较其与Met+Hcy-连用时显著（P

Met-Hcy+培养基联合应用化疗药物5-FU、DDP，可提高对胃癌细胞的杀伤作用，为提高肿瘤化疗疗效提供了一种新的途径。

1GuoHY，HerreraH，GroceA，etal.Expressionofthebiochemicaldefectofmethioninedependenceinfreshpatienttumorsinprimaryhistoculture.CancerRes，1993，53：2479.

2HoshiyaY，KubotaT，MatsuzakiSW，etal.Methioninestarvationmodulatestheefficacyofcisplatinonhumanbreastcancerinnudemice.AnticancerRes，1996，16(6B)：3515-3517.

生物细胞的培养范文篇9

1材料与方法

1．1材料

1．1．1实验动物

健康成年新西兰大白兔30只(由北京大学医学部实验中心提供)，雌雄不限，体质量1．0～1．5kg。

1．1．2主要试剂和仪器

ABCG2单克隆抗体(美国MILLIPORE公司)，细胞角蛋白(cytokeratin，CK)3单克隆抗体(美国MILLIPORE公司)，ANTI-BCRP1FITC(美国MILLIPORE公司)，黏蛋白5AC(MUC5AC)单克隆抗体(美国Abcam公司)，MTT(美国SCICRESTBIOTECH公司)。倒置相差显微镜(OLIMPUS，日本)，CO2培养箱(MCO-18AIC，SANYO公司，日本)，流式细胞仪(BD公司，美国)，酶标仪(SLT．SPETRAN公司，德国)，共聚焦显微镜(Zeiss公司，美国)，荧光显微镜(OLIMPUS公司，日本)。

1．2实验方法

1．2．1LSC的原代培养

采用组织块培养法。将兔子以过量乌拉坦静脉注射处死后，用碘伏棉球消毒眼睑周围3次，迅速取出眼球，在显微镜下去除眼球周围肌肉组织，生理盐水冲洗3次。在无菌条件下将处理后的眼球用含硫酸妥布霉素的生理盐水(硫酸妥布霉素注射液生理盐水=120配制)浸泡2次，每次15min;剪下角膜片，去除结膜、虹膜等组织，在体视显微镜下剪去角膜中央部分。无菌条件下将兔角膜缘组织剪成约1mm×2mm的组织块，将3～5枚组织块蘸取少量培养基后上皮细胞面向下置于培养皿中，放入37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，2h后待其贴附良好时加入适量含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，继续置于恒温CO2培养箱中培养。每2d更换1次培养基，每日在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录。

1．2．2LSC的传代培养

当细胞生长达到培养板的80%～90%时，PBS冲洗2次后，加入适量胰蛋白酶与细胞充分接触2～3min，待细胞变圆、细胞连接松弛时，加入含体积分数10%胎牛血清的培养基终止消化，吸管吹打使细胞脱离培养皿底，收集细胞悬液，1000r•min－1离心8min，按照12的比例接种于细胞培养皿及涂有多聚赖氨酸的细胞爬片上待测，每2d更换1次培养基，待细胞融合后，以同样方式继续传代。

1．2．3细胞形态学观察

倒置相差显微镜下观察各代LSC的爬出过程及生长状态，并将不同代数LSC固定(体积比为甲醇丙酮=11)，进行HE染色，显微镜下观察并拍照。

1．2．4LSC功能蛋白的表达

细胞免疫荧光检测:用固定液(体积比为甲醇丙酮=11)固定细胞爬片10min，将固定后的LSC爬片用PBS洗3次，然后用进口山羊血清封闭液封闭爬片30min，分别加入CK3(1100)、ABCG2(1100)、p63(150)、MUC5AC(1100)单克隆抗体，并以PBS代替一抗设阴性对照，4℃过夜孵育后分别加入IgG荧光二抗，室温孵育1h，DAPI复染细胞核，封片后激光共焦显微镜观察并照相，鉴定培养细胞CK3、p63、ABCG2及MUC5AC(1100)单克隆抗体的表达并拍照。

1．2．5流式细胞仪检测

将原代和传代后的LSC培养至形成单层，PBS洗2次，胰蛋白酶消化，1000r•min－1离心8min后，制成细胞悬液，用牛血清孵育30min，1000r•min－1离心8min后，细胞计数，然后每106细胞加入ABCG2-FITC单克隆抗体10μL进行标记，孵育30min，每10min摇匀1次，PBS洗2次，过细胞筛，流式细胞检测仪检测LSCAB-CG2-FITC单克隆抗体在培养细胞中所占的比例，比较原代和传代后LSCABCG2-FITC单克隆抗体的含量变化。

1．2．6MTT比色法测细胞活性

将50mgMTT溶于10mLPBS中，用0．22μm滤膜过滤后配制新鲜MTT液。细胞达到对数生长期时，消化、离心细胞，按照每孔2000个细胞的密度接种于96孔板，分别设12h、24h、48h、72h共4个时间点，每个时间点设5个复孔。每个时间点分别加入5g•L－1MTT溶液20μL，CO2培养箱中继续孵育4h后小心吸弃孔内培养液，每孔加入150μLDMSO，脱色摇床振荡10min，酶标仪测定各孔吸光度(A)值，参考波长为490nm。以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制各代细胞的生长曲线图，比较原代和传代细胞的增殖活性。

2结果

2．1培养细胞形态学观察

角膜缘组织块在置于培养皿上2～3h后贴附良好。倒置相差显微镜下可见，24h后有细胞从组织块边缘个体迁移，贴壁生长，呈多边形，体积较小，48h后细胞局部可见拉网样生长趋势，72h后出现大片细胞，细胞呈现多边形或多角形，96h细胞几乎铺满整个培养板(图1)。显微镜下可见3种细胞形态:(1)圆形、卵圆形，类似基底的柱状细胞，核浆比大;(2)多边形，类似翼状细胞;(3)大而扁平状，类似表层上皮细胞。细胞以卵圆形或多边形为主，多为2～3个核仁，部分可见丝状骨架结构。显微镜下可见，原代细胞生长状态良好，细胞以多边形及卵圆形为主，可见双核细胞、多核细胞及核分裂相，细胞间连接紧密;传代后第1代细胞呈规则多边形，可见双核细胞，细胞间连接紧密，类似上皮样细胞，可见少量纤维细胞;第2代细胞形态呈不规则状，几乎无双核细胞，无细胞间连接，完全失去上皮细胞的特性(图2)。

2．2培养细胞免疫荧光染色和检测结果

2．2．1细胞免疫荧光染色

经鉴定，培养的细胞CK3、ABCG2、p63单克隆抗体染色均呈阳性，MUC5AC单克隆抗体染色呈阴性，证明为LSC细胞(图3)。原代LSCCK3单克隆抗体间接免疫荧光染色多数细胞不着色，少数细胞着色，细胞质呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光;第1代LSCCK3染色阳性细胞较原代细胞增多，第2代LSCCK3染色阳性细胞进一步增多。原代LSCp63单克隆抗体表达有很高的阳性率，圆形及卵圆形细胞的细胞核均呈红色荧光;第1代LSCp63的表达与原代细胞无明显差异，第2代LSCp63的表达明显下降(图3-4)。

2．2．2流式细胞仪检测

流式细胞仪检测结果显示，原代、第1代和第2代LSCABCG2单克隆抗体阳性率分别为13．41%、22．96%和4．43%。2．3细胞增殖活性检测传代后细胞与原代细胞比较生长曲线有明显的下降，而且原代细胞有明显的细胞增长期，但第1代细胞生长曲线对数增长期不明显，第2代细胞几乎无增长期。各代细胞增殖活性差别显著(图5)。

3讨论

3．1LSC的培养

目前，LSC的培养方法主要有酶消化培养法和组织块培养法［11］，其中，组织块培养法应用最为广泛。Short等［12］通过比较酶消化培养法和组织块培养法表明，组织块培养法培养的细胞能更好地保持细胞原有形态，具有更多的桥粒连接和更紧密的细胞连接，能更好的保持角膜上皮细胞的功能。有文献报道，组织块培养法培养的LSC并不是单一的细胞，而是混合细胞，细胞包含一定量的LSC、短暂扩充细胞、分化的角膜上皮细胞及少量纤维细胞。在本实验中，利用组织块培养法体外培养兔角膜缘上皮组织，培养4d左右可达到80%～90%的融合状态，说明培养的角膜缘上皮细胞具有较强的分裂增殖能力;另外，形态学上细胞具有体积小，圆形或卵圆形，可见双核细胞、多核细胞及核分裂相，细胞间连接紧密等原始细胞生物学特性，说明组织块培养法培养的LSC具备作为LSC移植的种子细胞的特点。

3．2LSC的鉴定

现阶段国内外对LSC的基础研究仍然很薄弱，尤其是在LSC的标记物方面，迄今为止尚未找到一种LSC特异性表达分子标记物［1，6，13-14］，因此，只能选择几种目前比较确切的标记物组合如ABCG2、p63、CK3来鉴定LSC;在LSC中ABCG2、p63表达呈阳性，而CK3表达为阴性。AB-CG2蛋白在细胞膜和细胞浆内表达，阳性表达细胞分布于角膜缘上皮基底层的小细胞簇，其增生能力显著高于阴性细胞，最符合角膜上皮干细胞的特征。p63为一种白，表达于全角膜的基底层和基底细胞上层，其阳性表达是角膜缘强增殖能力细胞的标志［1，6，13-16］。CK3是一组非水溶性细胞骨架蛋白，在角膜上皮细胞特异地表达，被认为是角膜上皮分化细胞的标记物;然而CK3角膜基底层细胞不表达，呈现未分化的自然状态，为LSC鉴定的阴性标志物。MUC5AC是结膜细胞特异性表达标记物。本研究免疫荧光染色结果显示，培养的细胞CK3、ABCG2、p63抗体均呈阳性表达，而MUC5AC单克隆抗体为阴性表达，说明培养的细胞为角膜分化上皮细胞、LSC和短暂扩充细胞的混合细胞，且无结膜细胞的污染。本研究结果显示，p63在大部分原代细胞中表达阳性，第1代细胞p63表达与原代细胞比较无明显差异，而第2代细胞p63表达明显下降;CK3仅在少量原代细胞中表达，随着传代次数增加CK3表达阳性率逐渐增加。综合分析后表明，原代和第1代细胞能较好地保持LSC特性，可作为临床角膜缘上皮细胞移植的种子细胞。

3．3LSC含量的测定

生物细胞的培养范文篇10

述。

1胞外生物支架材料的应用

研究者对各种胞外支架材料进行了研究，包括聚乙烯树脂、海藻酸盐、聚氨酯泡沫等，都是具有亲水多孔性结构的天然或人工合成的有机大分子。在一定的培养条件下，肝细胞在基质孔隙中重组形成许多有功能的聚集体，这些聚集体中可能具有接近的细胞-细胞接触，且形成类似于体内组织的结构，因而表现出比早先单层贴壁培养的肝细胞更好的生理功能。

1.1海藻酸盐(alginate)海藻酸盐是目前常用的促进肝细胞聚集的物质，藻酸盐海绵体具有高度多孔的结构，孔径在100～150μm，由于藻酸盐是亲水性物质，所以肝细胞能容易地进入基质内部。Glicklis［1］等以藻酸盐海绵体为支持基质培养肝细胞。DNA测定表明最初两周肝细胞的数量并不增加，MTT测定显示绝大多数细胞保持活力。接种24h内在藻酸盐海绵状结构内观察到活细胞聚集体，这种聚集体在培养的第四天平均直径100μm，与基质孔径同一数量级。聚集体的三维结构促进了细胞功能的表达：1周内达最大白蛋白分泌量。微囊化肝细胞培养利用半透膜将肝细胞包在囊内(囊壁分子量截率

1.2聚氨酯泡沫(Polyurethanefoam，PUF)聚氨酯泡沫是另一种高度多孔性的过滤材料。日本Gion等［3］以PUF为材料设计出一种填充床式生物反应器，以该反应器为基础组成的混合型生物型人工肝（BioartificialLiver，BAL），在狗肝衰竭模型中，可显著降低血氨和血清肌酐，升高血糖和血压。Pahernik等［4］研究了以PUF材料进行猪肝细胞高密度培养的可行性，作者认为PUF是一种生物相容性较好的材料，适于肝细胞的高密度培养。Kurosawa等［5］采用聚氨酯膜(Polyurethanemembrane，PΜM)作为肝细胞培养支持物，构建固定床(fixedbed)生物反应器并用于大鼠肝细胞的高密度培养。PΜM孔径从上层到下层逐渐递减，肝细胞悬液流经PΜM时，5min内黏附的肝细胞密度可达2～3×107/cm3PΜM，黏附效率高达99%；黏附肝细胞以轻度聚集的球形体形式存在，白蛋白分泌持续时间比单层培养长。

1.3微载体(microcarrier)微载体目前经常用于生物型人工肝的肝细胞培养，可以大大提高生物反应器内肝细胞的培养密度。微载体细胞培养技术可以形成以微载体为核心的肝细胞聚合球，细胞浓度可达107cell/ml，使肝细胞不贴壁而呈悬浮状培养，更接近于正常的生理状态。Wermer等［6］用不同密度的永生化人肝细胞与不同浓度的明胶微载体进行旋转培养7d后，2×105cell/ml与1g/L微载体组获得的细胞浓度为4.5×106cell/ml；5×105cell/ml与3g/L微载体组细胞浓度为7.1×106cell/ml。微载体上沾满细胞，呈球形状态。肝细胞24h可产生5ng/ml乙基甘油二甲基苯胺(EMGX)，而用50ng/ml苯巴比妥诱导3d后，则产生26ng/ml的MEGX，显示了肝细胞代谢的潜能。目前，微载体培养是动物细胞大规模高密度培养中技术相对完善及有实用价值的一种培养模式，并且已有多种商品化的微载体可供选择。

1.4中空纤维(hollowfiber)中空纤维是人工合成的高分子材料半透膜，纤维内腔直径约200μm。将数百或数千束纤维装在容器中，即中空纤维舱，最常用于构建生物型人工肝生物反应器。Liu等［7］对体外中空纤维肝辅助装置中的永生化猪肝细胞进行了研究，发现细胞接种后增殖迅速，在培养的25d期间，肝细胞保持着对安定及扑热息痛的代谢活性。超微结构检查可见形成胆小管结构的桥粒及连接复合体。Sosef［8］等将猪的自体肝细胞置于中空纤维仓，培养24h后治疗猪急性肝功能衰竭（FHF）模型，明显延长存活时间，降低血氨水平。在多种材料结合的基础上，研究者提出并尝试了多种有应用价值的肝细胞培养系统。Arnaout［9］等在中空纤维外腔植入微载体培养的肝细胞构建生物型人工肝，对FHF和慢性先天性代谢性肝病动物模型均有肝辅助作用。Nyberg［10］等在中空纤维内腔内种植胶原凝胶包埋肝细胞，培养液在胶原外纤维内循环，形成肝细胞培养的三维框架，患者血浆在纤维外灌流，体外实验证明此系统具有合成蛋白功能及药物代谢功能，动物实验能改善FHF动物模型肝功能指标，但未见进一步的临床应用报道。Dixit［11］将两种不同的中空纤维管置于同一外壳内，其中一种通过培养液，纤维外部附肝细胞;另一纤维管循环宿主血液/血浆。体外实验研究表明这种肝细胞反应器可提供特异性的肝细胞功能。Gerlach［12］等将细胞培养于三维网状交叉的中空纤维之间，实验表明可使肝细胞高密度培养，肝细胞功能维持可达5周。FunatuK［13］等用聚氨酯泡沫(polgurethanefoam，PUF)在离心条件下中空纤维内培养肝细胞，3d内形成表面光滑的柱型组织化结构(Organoid)，维持肝功能达4个月以上，Nakazawa［14］应用此种生物反应器治疗FHF猪动物模型可改善其生化指标，提高生存率。

1.5其他TobeS［15］等报道大鼠的肝细胞能够附着着在一种缺乏唾液酸蛋白的聚DP苄乙烯D乳酰氨(polyNpvinylbenzylDlactonamide，PVLA)上形成锚定的多层聚集体，在培养液中加入EGF和胰岛素时形成稳定的三维结构。这种聚集体中的肝细胞有很高的白蛋白分泌能力，作者推测可能是多层聚集体中的细胞通过聚集体的形成而稳定地分化所致。Ohshima等［16］将聚乙烯树脂(Polyvinylformal，PVF)置于一圆柱形容器内组成一种填充床式生物反应装置，适于肝细胞的培养密度可达107cell/cm3，且培养肝细胞具有良好的氨代谢、尿素合成及分泌白蛋白等功能；扫描电镜观察显示，肝细胞在形态及排列等方面均优于单层培养。

2模拟微重力培养

模拟微重力肝细胞培养是利用旋转式生物反应器，提供一个模拟微重力的条件，反应器内培养的细胞呈一种失重状态，可自发形成组织样结构。研究者们在一系列的细胞三维培养研究中先后取得重要进展表明，利用回转生物反应器(RotatingWallVesselBioreactor，RWVB)模拟微重力培养环境，可以显著改善离体细胞的生长状况，使在普通培养条件下只能二维贴壁生长的动物细胞表现出三维增殖与分化。Risek等［17］等利用模拟微重力培养环境共培养纯化的肝细胞与胆管上皮细胞，发现肝细胞与胆管上皮细胞自发聚集于聚合物支架上，生长达2个月，在三维结构上肝组织内有肝索、胆管以及管状内皮结构形成。国内张钰鹏［17］也在模拟微重力条件下进行大鼠原代肝细胞微载体培养，多个微载体表面的肝细胞可连接成团，形成“肝细胞微载体聚球体”的基本结构模式。透射电镜下，肝细胞在不同部位显现不同的膜结构：与培养液接触的表面出现许多不规整的微绒毛，类似体内的肝窦面。肝细胞之间则胞膜平直，膜间缝隙狭窄，类似体内的肝细胞间接触面。

3展望

生物细胞的培养范文1篇11

【关键词】骨髓基质干细胞；髋关节；软骨缺损；组织工程

关节软骨损伤修复是骨科学研究的热点，组织工程技术的出现为关节软骨损伤的治疗提供新思路。目前常用的研究方法为在体外培养扩增种子细胞，在体外与生物材料结合后直接植入体内修复关节软骨缺损[1]。我们通过组织工程技术在体外构建组织工程软骨，并应用于修复兔股骨头关节软骨损伤，现报告如下。

1材料与方法

1．1实验动物3月龄健康新西兰大白兔16只，雌雄对半，体质量2．1～3．4kg，购自上海中科院实验动物中心。

1．2主要实验仪器和试剂CO2培养箱（HERA），超净工作台（苏州净化设备厂），倒置显微镜（Olympus），DMEM培养液、0．25%胰蛋白酶、细胞因子TGF-β、b-FGF（Sigma），小牛血清（杭州四季青生物公司），Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒（北京中杉生物公司），RNA提取试剂盒（QIA），RT-PCR试剂盒（晶美生物公司），组织细胞染色（本院病理科提供），生物材料胶原膜由中科院生物医学工程研究院提供。

1．3实验方法

1．3．1骨髓基质干细胞的获取可取自两侧髂棘，用16号骨髓穿刺针抽取骨髓2ml，针筒内预先置入1mlDMEM培养液（含肝素1000U），以3∶7的比例加入淋巴细胞分离液，以2000r/min，15min离心，吸取中间单个核细胞层，再用DMEM培养液冲洗3次，血球计数板计数。

1．3．2骨髓基质干细胞培养按15×105/ml细胞浓度培养，培养液DMEM培养基含小牛血清12%、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml，培养条件为5%CO2、37℃、饱和湿度，培养3d后更换所有培养液，以后隔天换液1次至细胞单层融合，应用0．25%胰酶消化获得第一代骨髓基质干细胞用于诱导分化实验。

1．3．3骨髓基质干细胞诱导分化取上述细胞，加入含25ng/mlTGF-β、2ng/mlb-FGF和12%小牛血清的DMEM诱导分化培养液，2d换液1次，7d传代1次，获取第3代细胞作为本研究实验细胞。

1．3．4体外组织工程化软骨的构建取上述细胞悬液进行浓缩，密度为2．5×107/ml，滴注到胶原膜上，4h后缓慢加入诱导分化培养液，3d半量换液1次，维持培养2周后用于检测及体内实验。

1．3．5体外构建组织工程软骨特性检测取上述构建的组织工程软骨福尔马林固定、石腊包埋、切片，HE染色，阿新兰染色，RT-PCR进行Ⅱ型胶原基因表达检测。

1．3．6股骨头关节软骨缺损模型制作与组织工程修复1%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，常规消毒铺巾，取兔髋关节外侧纵形切口，切开髋关节外侧肌群，暴露髋关节关节囊，“T”切开关节囊，手法致髋关节脱位，暴露股骨头，用环钻人为造成股骨头负重区直径约3mm、深约3mm关节软骨缺损，取上述构建的组织工程软骨，交替植入一侧软骨缺损区为实验组，相应的另一侧不作任何处理为空白对照组或单纯用胶原膜修复为材料（实验组16个缺损，空白对照8个缺损，材料对照8个缺损）。手法复位，认真缝合髋关节关节囊及各层组织，术后让动物自由活动，于8、16周后处死动物，取髋关节软骨缺损修复情况。

1．3．7组织学检查取修复组织福尔马林固定后，脱钙后石腊包埋、切片、HE染色，Ⅱ型胶原免疫组化染色，观察修复结果。

2结果

2．1骨髓基质干细胞分离与培养分离的细胞在培养第2天开始出现细胞贴壁生长，呈纺缍形、多角形、短梭形，细胞增殖旺盛，8d后长满培养瓶，在倒置显微镜下细胞形态一致。

2．2组织工程化软骨的特性经诱导分化培养2周后胶原膜与细胞复合体体积变化不明显，质地仍较软。HE染色显示复合体内细胞呈梭形，未见明显软骨陷窝，RT-PCR可检测出Ⅱ型胶原基因有较强的阳性表达，阿新兰染色显示细胞周围基质强阳性着色。

2．3大体标本术后全部动物自主活动良好，伤口愈合好，未见明显感染,术后8周取大体标本观察，见修复组股骨头负重区关节软骨缺损处有白色软骨样组织修复，缺损填充平整；术后16周关节软骨缺损仍为白色软骨样组织修复，部分见表面粗糙；两对照组未见修复，见明显关节软骨缺损区。

2．4组织学观察术后8周HE染色片光镜下见修复组修复组织为透明软骨样组织，厚度接近正常，与周围软骨面结合好，表层细胞为梭形成纤维样软骨细胞，中下层以圆形透明软骨样细胞为主，可见呈柱状排列，与软骨表面相垂直，软骨陷窝清晰可见，与底层软骨下骨连接良好；术后16周软骨陷窝仍清晰，但镜下可见软骨细胞排列紊乱。对照组为明显缺损区，部分为纤维样组织修复。

2．5组织化学染色与免疫组织化学染色对修复组织切片后进行阿新兰染色，见细胞周围基质被染成深蓝色，Ⅱ型胶原免疫组化染色显示修复组织中细胞的细胞质和细胞外基质Ⅱ型胶原强阳性表达；对照组纤维样组织Ⅱ型胶原免疫组化染色阴性。

3讨论

关节软骨组织工程构建的基本原理是在体外培养扩增获得大量软骨细胞，与可吸收材料结合塑形后植入体内代替损伤的软骨组织，近年来的研究发现软骨细胞在体外扩增极易产生去分化现象，从而失去软骨细胞表型，不是理想的种子细胞[2]。

骨髓基质干细胞是一种多能干细胞，已证实其在特定条件下可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞甚至神经元细胞，但是在骨髓中骨髓基质干细胞的含量极低，需要大量的骨髓才能获得足够细胞量[3]。而且我们前期的实验已证实经过大量传代后骨髓基质干细胞仍保持分化成软骨潜能，应用含25ng/mlTGF-β、2ng/mlb-FGF和12%小牛血清的DMEM培养液可将骨髓基质干细胞成功诱导分化为软骨样细胞[4]。

细胞在体外培养时易产生接触抑制从而影响细胞的生长和功能，本研究中应用的多孔胶原膜可以为骨髓基质干细胞提供生长和增殖空间，有利于细胞的营养摄取和物质交换，阿新兰染色和基因检测显示所构建的组织有特异性Ⅱ型胶原和酸性粘多糖（GAG）表达，符合软骨组织特性。本研究结果显示在修复后8周关节软骨缺损修复良好，但16周后部分关节出现不同程度的退行性改变，其可能的原因是骨髓基质干细胞在体外的诱导培养时间过长，从而失去干细胞的某些特性，改善培养环境及条件是继续研究的方向。

参考文献

1陈雷,杨志明,林建华，等.组织工程软骨对兔膝关节胫骨平台浅层全关节软骨缺损的修复作用.中华实验外科杂志，2006,23(8):982-984.

2杨柳,段小军,戴刚,等.人间充质干细胞体外成骨诱导培养及其生物学特性变化.第三军医大学学报,2002,24（2）:509-512.

生物细胞的培养范文篇12

【摘要】目的研究叶酸偶联5?氟尿嘧啶?白蛋白在体外对肿瘤细胞的毒性及经叶酸受体介导的靶向性。方法选用叶酸受体表达阳性fr(+)宫颈癌hela细胞及叶酸受体表达阴性fr(-)肺癌a549细胞进行实验。用mtt法观察叶酸偶联物对细胞的毒性作用,同时利用游离叶酸能与叶酸偶联物竞争性结合叶酸受体的原理，考察叶酸偶联物是否具有经叶酸受体介导的靶向性。结果叶酸偶联物对fr(+)hela细胞具有比5?氟尿嘧啶原料药更高的抑制率,能有效的靶向fr(+)hela细胞,且细胞毒性作用能被过量的外源性游离叶酸所抑制,而叶酸偶联物对fr(-)a549细胞作用很弱。结论叶酸偶联的5?氟尿嘧啶?白蛋白能经叶酸受体介导靶向于叶酸受体丰富的肿瘤细胞。

【关键词】叶酸偶联;5?氟尿嘧啶;细胞毒性;靶向性

abstract:objectivetostudythecytotoxicityandtargetingabilityoffolate?conjugated5?fluorouracil?albuminviafolatereceptor?mediatedendocytosisontumorcellsinvitro.methodsthefolatereceptorpositivefr(+)helacellandfr(?)lunga549cellwereusedforexperiment.thecytotoxicityofthefolate?conjugateontumorcellswasmeasuredbymttassay.accordingtothecompetitiveinhibitionprincipleandduetothatfreefolatehadhighaffinityforfolatereceptor,freefolicacidwasusedtovalidatewhetherfolate?conjugatehasthetargetingabilitytofr(+)helacellviafolatereceptor?mediatedendocytosis.resultsthecytotoxicityoffolate?conjugatetofr(+)helacellwasstrongerthan5?fluorouracilcrudedruginthesameconcentration,andcouldbeinhibitedbyexcessfreefolicacid,whilethecytotoxicityonfr(-)lunga549cellwasveryweak.conclusionfolate?conjugated5?fluorouracil?albumincouldbetargetedintotumorcellswithrichfolatereceptorsviafolatereceptor?mediatedendocytosissignificantly.

keywords:folate?conjugated;5?fluorouracil;cytotoxicity;targeting

目前,肿瘤细胞叶酸受体受到广泛关注,已成为肿瘤诊断和治疗研究的新靶点[1-4]。国内外研究都证明了利用叶酸对受体的高度亲和性,可将药物-叶酸偶联物经叶酸受体介导靶向到高度表达该受体的肿瘤细胞(如鼻咽癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌等),这些肿瘤细胞膜表面上的叶酸受体活性和数量显著高于一般正常细胞[5-8],这为叶酸受体介导药物靶向于肿瘤细胞的研究奠定了基础。据此,本研究以叶酸为靶向基团合成了叶酸偶联的5?氟尿嘧啶?白蛋白,采用mtt法[9]观察叶酸偶联物对肿瘤细胞的毒性作用,利用游离叶酸能与叶酸偶联物竞争性结合叶酸受体的原理,验证该叶酸偶联物是否具有经叶酸受体介导的靶向性。

1实验仪器与材料

1.1实验仪器

sw?tj水平流净化工作台(苏州市净化设备总厂);model?680型酶联免疫检测仪(美国bio?radlaboratories);hy?5回旋式振荡器(江苏省金坛市宏华仪器厂);dk?8d型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司);倒置相差显微镜(德国leicadmil);培养箱(thermoforma371);sz?93自动双重纯水蒸馏器(上海雅荣生化设备仪器有限公司)。

1.2实验材料

宫颈癌hela细胞、肺癌a549细胞(本院药理教研室保存);mtt(thiazolylblue噻唑兰,sigma分装,北京鼎国生物技术有限责任公司);rpmi1640培养液(吉诺生物医药技术有限公司);rpmimedium1640无叶酸培养基(cibco);特级胎牛血清(天津市濒洋生物制品科技责任有限公司);胰酶(sigma,北京利科恒达科贸有限公司);96孔培养板(加拿大jetbiochemicalsint?l.，inc);叶酸(企业标准，上海新量化工试剂有限公司);5?氟尿嘧啶(5?fu，南通精华制药有限公司);5?氟尿嘧啶?白蛋白(5?fu?b，实验室自制);叶酸偶联的5?氟尿嘧啶白蛋白(5?fu?b?f，实验室自制),其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1药物在体外的细胞毒性[10,11]

实验分5组:空白对照组(不加细胞)、阴性对照组(加细胞,不加药)、5?氟尿嘧啶组(5?fu,阳性对照组)、5?氟尿嘧啶?白蛋白组(5?fu?b,不接叶酸)、叶酸偶联的5?氟尿嘧啶白蛋白组(5?fu?b?f,接有叶酸),用含10%(φ)胎牛血清rpmi1640培养液培养细胞,取处于对数生长期、生长状态良好的细胞,用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,离心使细胞沉淀,用pbs洗涤,用含10%(φ)胎牛血清无叶酸rpmi1640培养液配成单个细胞悬液,细胞密度为105个/ml以每孔104个细胞接种于96孔培养板中,每孔100μl。将培养板移入培养箱中,在37℃、5%co2及饱和湿度条件下分别培养24h后更换100μl无叶酸rpmi1640培养液,并分别加入5?fu,5?fu?b,5?fu?b?f药液各100μl,使终质量浓度分别为2μg/ml,10μg/ml,50μg/ml的(偶联物均折算成5?fu的等价浓度),再培养36h后,每孔更换为100μl无血清无叶酸rpmi1640培养基的培养基,加入20μlmtt溶液(5mg/ml),在微量振荡器上振荡3min,继续培养4h,弃培养液,孔加入150μldmso,酶联免疫检测仪测定490nm吸光度(a)。每种药物浓度设6个复孔。根据抑制率=(1-a药物/a对照)×100%计算抑制率,并以抑制率对药物浓度作图,结果见图1。从图1a中可看出,叶酸偶联物5?fu?b?f的对宫颈癌fr(+)hela细胞的毒性最强,其次是5?fu,5?fu?b的细胞毒性最弱。而在图1b中原料药5?fu对fr(-)a549细胞的毒性最强,叶酸偶联物5?fu?b?f与无偶联叶酸的5?fu?b?f对fr(-)a549细胞的毒性都很低。

2.2药物在体外的细胞靶向性验证[12]

实验分6组:空白对照组(不加细胞)、未加叶酸的阴性对照组(加细胞,不加药,也不加叶酸)、加有叶酸的阴性对照组(加细胞,不加药,但加有叶酸)、5?fu、5?fu?b、5?fu?b?f,给药质量浓度均为10μg/ml(偶联物均折算成5?fu的等价浓度),分别用质量浓度为0.1、1、10μg/ml叶酸进行阻断。用含10%(φ)胎牛血清rpmi1640培养液培养细胞,取处于对数生长期、生长状态细胞,用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,离心使细胞沉淀,用pbs洗涤,用含10%(φ)胎牛血清无叶酸rpmi1640培养基配成单个细胞悬液,细胞密度为105个/ml,以每孔104个细胞接种于96孔培养板中,每孔100μl。将培养板移入培养箱中,在37℃、φ=5%co2及饱和湿度条件下分别培养24h后更换100μl培养液,并分别先在各组中加入50μl游离叶酸(叶酸质量浓度分别为0.4、4、40μg/ml,以使得叶酸终质量浓度为0.1、1、10μg/ml)阻断叶酸受体,再分别加入50μl,5?fu,5?fu?b,5?fu?b?f药液使各药物终质量浓度为10μg/ml(偶联物折算成5?fu的等价浓度),培养36h后,同“2.1”mtt法测抑制率,并以抑制率对药物浓度作图,结果见图2,从图2a中可以看出,叶酸偶联物?fu?b?f对叶酸阳性受体fr(+)hela细胞的细胞毒性因游离叶酸的浓度不断增大而显著减弱,而游离叶酸对5?fu,5?fu?b基本不影响;从图2b中可看出叶酸受体阴性fr(-)a549细胞中游离叶酸的加入对5?fu,5?fu?b,5?fu?b?f的细胞毒性均无影响。

3讨论

研究发现,外源性的叶酸?药物复合物与细胞膜表面的叶酸受体特异性结合叶酸?药物/叶酸受体复合物周围形成凹陷,在细胞内形成内涵体,在核内体膜质子泵的作用下,内涵体内ph下降,使叶酸-药物/叶酸受体复合物的构象改变,药物从复合物上解离,药物被释到细胞内,而叶酸受体可再回到细胞膜表面,循环转运药物[13]。

实验数据处理时用阴性对照减去空白对照的值作为对照的,所有组别吸收值都减去空白值再进行抑制率的计算,阴性对照组是真正的对照组,是加有细胞的;空白对照是不加细胞的,是由于培养基及mtt本身所引起的吸收值,不是由于mtt被细胞还原引起的,故应减去空白值,再进行抑制率的计算。细胞靶向性实验结果发现，无叶酸的对照跟加有叶酸的对照没什么差别,说明叶酸本身对细胞生长没什么影响。为了保持实验的可比性和可靠性,选用了有加叶酸的阴性对照组减去空白组的值作为对照计算抑制率。

体外细胞毒性实验结果表明,叶酸偶联物5?fu?b?f对宫颈癌fr(+)hela细胞有靶向作用,可经叶酸受体靶向到叶酸受体阳性fr(+)hela细胞,故显示出比原料药5?fu更强的细胞毒性,这是因为叶酸偶联物和叶酸受体的结合具有特异性、选择性、亲合力强的特点,通过受体介导作用,增加药物fr(+)hela细胞浓度，可提高疗效,降低毒副作用,达到靶向作用。5?fu?b无偶联叶酸对fr(+)hela细胞的毒性较弱,且由于分子量增大，不利于其穿透细胞膜进入细胞内部,只能经内吞作用进入肿瘤细胞,故作用不及原料药5?fu;而fr(-)a549细胞为叶酸受体阴性细胞,故叶酸偶联物5?fu?b?f不能经叶酸受体介导靶向到fr(-)a549细胞内,与5?fu?b一样只能经内吞作用进入细胞内,故毒性很弱,都不及原料药5?fu的细胞毒性强。

体外细胞靶向性验证实验中,5?fu、5?fu?b?对fr(+)hela细胞和fr(-)a549细胞的细胞毒性均不受游离的叶酸所影响,前者是因为药物无偶联叶酸,后者是因为fr(-)a549细胞为叶酸受体阴性细胞,5?fu?b?f只能经内吞作用进入细胞内,故对游离叶酸不敏感;在fr(+)hela细胞中,先加入外源性叶酸进行抑制后,fr(+)hela肿瘤细胞膜表面的叶酸受体被过量的叶酸阻断,叶酸偶联物5?fu?b?f无法经叶酸受体介导到宫颈癌fr(+)hela细胞,只能通过内吞作用进肿瘤细胞内,故叶酸偶联物5?fu?b?f对fr(+)hela的细胞毒性随着游离叶酸的浓度不断增大而显著降低。这间接证实了叶酸偶联5?fu?b?f可通过fr(+)hela细胞膜表面的叶酸受体介导进入细胞。

在实验中,换用无叶酸rpmi1640培养液基于以下两点理由：(1)普通rpmi1640培养液中含有的叶酸量是体内正常血浆中的1000倍，而高浓度的叶酸可竞争抑制细胞对叶酸偶联物的摄取,从而影响到实验结果。(2)无叶酸rpmi1640完全培养液中含有的10%小牛血清是细胞所需叶酸的唯一来源,以保证细胞在生理状态的培养液中生长[12]。

本实验探讨了叶酸偶联的5?氟尿嘧啶?蛋白体外肿瘤细胞毒性和靶向性,证实了叶酸偶联白蛋白可经叶酸受体介导途径靶向富集于叶酸受体丰富的肿瘤细胞,为进一步研究及进行体内动物靶向性研究提供参考。

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