化学冻伤处理方法范文

关键词：白三叶叶片；酸沉降；冻融胁迫；抗氧化酶；MDA

中图分类号：Q945.78文献标识码：A文章编号：0439-8114（2015）09-2083-04

白三叶草（Trifoliumrepens）属于豆科车轴草属，是多年生草本植物。其适应性强，耐寒、耐热、耐干旱，且分布范围广。它是一种优良的豆科牧草，被广泛应用于园林绿化和草坪建植，也是一种重要的绿肥植物，在发展园林绿化及园林生态建设上起重要作用[1-3]。

酸雨是指pH小于5.6的雨、雪或其他方式形成的大气降水[4]。近20年来，我国酸性气体造成的大气污染不断加剧。继北美、欧洲之后，中国已经成为世界第三大酸沉降区，且酸雨区面积呈加速发展的趋势[5]。特别是中国北方地区，冬季供暖，加重了酸雨的侵蚀，已经对中国经济造成巨大损失[6，7]。同时，温度是主要影响白三叶草坪生长的环境因子，随着全球气温不正常变化导致的融冻型冻害，对园林景观也造成一定的损害[8]。

逆境条件下，植物往往容易产生较多的丙二醛（MDA），能与蛋白结合形成交联物，引起生物体大分子蛋白、核酸变化，从而改变细胞膜系统，因此通常用MDA评价植物质膜受损程度的指标；同时在胁迫条件下，植物会产生大量的活性氧合自由基，引起膜的过氧化和伤害，而过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）在清除活性氧自由基和防止膜脂过氧化维持膜完整性上起重要作用。为此，将通过酸沉降及冻融胁迫的方法，测量白三叶叶片可溶性蛋白、MDA、抗氧化酶（SOD、CAT、POD）在此过程中生理指标变化和冻融胁迫后恢复能力，以期了解白三叶对温度、酸沉降适应的生态幅，可为未来作物抗冻及防治酸沉降对草坪草的危害提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1白三叶供试白三叶品种兰迪（Landy），由吉林省农业科学院提供。于2014年4月初挑选饱满粒大的种子，采用撒播方式，将种子播撒在吉林大学环境与资源学院室外试验田中（N43°83′35.3″，E125°28′75.2″）。试验田土壤有机质含量为32g/kg，全氮1.012g/kg，全磷0.428g/kg，全钾21.55g/kg，土壤平均pH6.9。取表层土壤将白三叶种子覆盖，避免暴晒，播种初期定时人工浇水，待长出幼苗，减少浇水量及次数。尽量保证植物生长环境，如光照，湿度、温度、土壤组分等相同。

1.1.2模拟酸沉降溶液根据长春市天然降水pH及离子水平，考虑到天然降水离子成分的复杂性，选择自来水配制模拟酸沉降的原溶液，再用浓硫酸与浓硝酸（SO42-∶NO3-=5∶1）配制pH4.5模拟酸沉降溶液[9]，进行模拟酸沉降淋浇，试验以自来水作为对照组（CK）。模拟酸雨pH由pHS-3C型雷磁酸度计测定与校对。

1.2试验方法

1.2.1酸沉降试验将试验田分为2组，分别为pH组、CK组，每组面积大小为10m×3m，每组之间有2m缓冲区。试验于2014年7月对pH组进行模拟酸沉降淋浇，周期为40-55d，每8d喷淋一次，喷淋时间为17：00～18：00，单次喷淋量相当于10mm降雨量，选用塑料压力喷壶作为人工模拟降雨器，将配制溶液均匀喷至pH组内，通过调节壶内压力调节降雨强度，调节喷头控制酸雨雨滴大小。

1.2.2人工冻融试验于2014年9月，在试验田中分别从pH组、CK组中随机用撬铲取长、宽、深均为0.25m的白三叶样品，各6份，标记好后将带有土壤及根系的试验材料从室外采样，送回实验室（15℃）过夜，第二天早晨开始融冻-冻融处理。融冻试验处理为每2h降温5℃，一样的冻融试验为每2小时升温5℃，试验的温度设计为5、0、-5、-10、-15、-10、-5、0、5℃，每2h一变温随即取样，每次分别从pH组、CK组随机剪取叶片混匀后用锡箔纸包裹放入液氮中固定，将活性保存，随后放于-80℃超低温冰箱中，用于各项生理指标测定。

1.2.3生理指标测定方法硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定丙二醛（MDA）含量[10]；考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量[10]；分别采用SOD、POD、CAT试剂盒测定其活性。每个指标做3组平行样。

2结果与分析

2.1酸沉降及冻融胁迫对白三叶叶片可溶性蛋白含量的影响

试验中，酸沉降胁迫处理下的叶片可溶性蛋白含量均比对照组低，降低了2.85%～24.18%，这可能是由于酸沉降使白三叶草体内的蛋白质合成酶活性降低或遭到破坏，导致生理代谢紊乱，然而蛋白质溶解酶活性增强，导致分解加快，说明酸沉降处理引起植物组织中可溶性蛋白质含量的降低，这与胡雁春[11]对白三叶耐酸性研究结果一致。

在融冻阶段，温度由5℃降低到-5℃时，酸雨组和对照组中叶片可溶性蛋白含量均增加并达到最高，分别为31.44mg/g、36.79mg/g，分别增加了23.05%、33.84%，当温度持续下降到-15℃，可溶性蛋白质含量下降，达到pH组、CK组最小值，分别为19.43mg/g、20.74mg/g。在冻融阶段，温度回升至-5℃，叶片可溶性蛋白含量又增加达到第二个高峰，分别为29.33mg/g、30.45mg/g，在持续升温过程中含量基本保持不变（图1）。这与Fleck等[12]对冬小麦叶片稳定蛋白质积累与其抗冻性研究结果一致，说明抗冻性强的品种能更有效地刺激积累保护物质，低温胁迫使根系细胞内可溶性蛋白含量增加，有效缓解细胞代谢抵抗低温。Guy[13]也得出过类似的结论。

2.2酸沉降及冻融胁迫对白三叶叶片丙二醛含量的影响

酸沉降胁迫处理下的丙二醛含量高于对照组，增加了0.60%～18.82%。说明酸沉降处理引起植物叶片MDA含量的积累，MDA是膜脂过氧化的主要产物之一，MDA含量越高越不利于植物生长。这与吴杏春等[14]的试验结果一致，在酸雨胁迫下，造成MDA的相对含量升高，加剧膜的损伤。

融冻-冻融胁迫中，酸沉降组与对照组中MDA活力变化趋势相同。融冻阶段，温度从5℃降到-15℃，白三叶结冻，叶片丙二醛含量呈上升趋势，pH组、CK组最大值均出现在-15℃，分别为4.04、3.97μmol/L，相对5℃分别增加了31.08%、53.77%。在冻融阶段，白三叶开始解冻，丙二醛含量持续下降，与最高值相比，pH组、CK组分别下降了36.97%、44.26%（图2）。这说明低温胁迫下细胞内活性氧代谢的平衡被破坏从而有利于活性氧的产生，活性氧过剩的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，MDA含量多少代表膜损伤程度的大小，这与范玉贞[15]关于白三叶抗冻生理机理研究结果一致。

2.3酸沉降及冻融胁迫对白三叶叶片CAT活力的影响

在酸沉降胁迫处理下的CAT活力与对照组变化趋势不明显，这可能与在较轻的酸沉降胁迫下，并没有引起其抗性变化有关。CAT存在于过氧化物体内，可以清除自由基，使细胞膜避免损害，说明酸沉降处理并不会引起植物组织中CAT含量有大幅变化。

在融冻阶段，随温度的降低，白三叶叶片CAT活力增高，-5℃时pH组、CK组CAT活力均达到最大值，分别为11.49、11.28U/mg，相对于5℃分别升高了33.88%、26.31%，而当温度继续下降时，CAT活力明显下降。在冻融阶段，随温度的升高，CAT活力先下降后趋于平稳（图3）。这与安莹等[16]试验结果一致。可见融冻过程中-5℃时，对白三叶是没有伤害的，但随着温度继续降低，CAT活力明显下降，且在冻融升温阶段，未见活力上升，说明低温产生大量H2O2，而过量的H2O2无法消除，致使CAT活力下降，引起膜脂过氧化对叶片产生伤害。

2.4酸沉降及冻融胁迫对白三叶叶片POD活力的影响

本试验中，酸沉降胁迫处理下POD活力比对照组高，增加了10.34%～24.47%，说明酸沉降处理引起植物组织中POD含量增加。POD是植物细胞的保护性酶，它的变化能在一定程度上反映品种的抗酸性大小，活性越高，变化越大，抗酸能力越强[11]。

白三叶叶片POD活力在融冻阶段随温度下降而增高，在叶片完全冻结（-5℃）时，pH组、CK组达到最高分别为81.15、65.19U/mg，升高了17.84%、12.88%。随温度继续降低，POD活性也随之下降，并在-15℃达到最小值分别为60.75、54.86U/mg，下降了33.59%、18.84%。在冻融阶段，随温度升高叶片解冻而活性上升，随后趋于稳定（图4）。Zhou等[17]和Guo等[18]对高寒山区的多年生牧草中抗氧化酶活力变化的研究与本试验结果一致。

2.5酸沉降及冻融胁迫对白三叶叶片SOD活力的影响

在酸沉降胁迫下，白三叶叶片SOD活性高于对照组，增加了0.09%～18.11%，说明在适度酸沉降胁迫下可激发植物自身抗逆体系，诱导SOD活性增大，减少活性氧对膜脂的过氧化作用，这与齐泽民等[19]研究结果一致，说明酸沉降胁迫提高了叶片SOD活性。

融冻-冻融胁迫试验中，随温度下降，叶片SOD活力增高，在-5℃达到最高，pH组、CK组分别达到135.24、130.65U/mg，增加37.36%、46.22%。当叶片完全结冻时（-15℃）SOD活力下降，pH组、CK组分别为110.37、110.48U/mg。冻融阶段，当温度回升至-5℃时，pH组SOD活力再次上升，为119.02U/mg。随着升温，白三叶解冻，SOD活力又降低，但值仍较高（图5）。在融冻和冻融阶段，SOD活性均在-5℃达到最高值，这说明白三叶叶片SOD在-5℃时反应比较敏感。这说明逆境胁迫会促进活性氧产生，损伤膜系统，植物体内SOD活性的升高现已被普遍认为是植物抵抗低温逆境的一种生理反应[16]。这与张圣平等[20]在低温胁迫对野生黄瓜嫁接苗的研究结果一致。

3结论

在酸沉降及变温胁迫下，白三叶叶片中丙二醛含量增加，加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，白三叶通过快速激活过氧化物酶、过氧化氢酶及超氧化物酶的活力，来防御离子自由基对细胞的伤害，从而保护白三叶对胁迫的适应，使白三叶仍可以继续生长。结果表明白三叶对未来气候引起的冻融型及酸沉降型伤害有很强的适应性，具有草坪绿化价值，是值得推广的优良园林植物。

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化学冻伤处理方法范文篇2

关键词：低温；危害；预防

冻害是树木因受低温伤害而使细胞和组织受伤，甚至死亡的现象。低温既可伤害树木的地上或地下组织与器官，又可改变树木与土壤的正常关系，进而影响树木的生长与生存。树木在生长发育过程中常遭受冻害、冻旱、寒害、日灼、风害、旱害等自然灾害的威胁低温对树木造成的危害轻则降低树木的观赏价值及生长发育，重则导致树木死亡。

一、低温危害的部位与原理

根系冻害。因根系无自然休眠，抗冻能力较差。靠近地表的根易遭冻害，尤其是在冬季少雪干旱的沙土之地更易受冻，因此冬春季节要做好根系越冬保护工作。

根茎冻害。由于根茎停止生长最晚，抗寒力差，同时接近地表温度变化大，所以根茎易受低温和较大变温的伤害，使皮层受冻。一般可用培土的方式防寒。

主干、枝权冻害。主干由于在初冬和早春，温差大，皮部组织随日晒温度增高而活动，夜间温度骤降而受冻。同时由于初冬气温骤降，皮层组织迅速冷缩，木质部产生应力而将树皮撑开；细胞间隙结冰，也可造成裂缝。

枝权冻害。发生在分权处向内的一面，主要因为分权处年轮窄导管不发达，供养不良营养积存少，抗寒能力差之故。同时，分权处易积雪，化雪后浸润树皮使组织柔软，气温突降即会受害。

二、抗低温伤害的主要预防措施

树木忍耐低温的能力受许多非人为控制因素的影响，但是我们可以在一定范围内采取合理的预防措施，减少低温的伤害，在生产中对低温伤害的防治，国内外均有一些成熟的经验措施，但必须经过理论分析和验证，在不违背遗传规律基础上，加以综合运用和提高，以求收到实效。下面介绍以下几种措施，以供缺究及生产之用。

2.1择扰寒的树种或品种,贯彻适地适树的原则

这是减少低温伤害的根本措施，乡土树种和经过驯化的外来树种或品种，已经适了当地的气候条件，具有较强的杭逆性，应是园林栽植的主要树种。新引进的树种上，一走要经过试种，证明其有较强的适应能力和抗寒性才能推广，处于边缘分布区的树种上，选择小气候条件较好无明显冷空气集聚的地区栽植，可以大大减少越冬防寒的工作量。在一般情况下，对低温敏感的树种上应栽植在通气、排水性能良好的土壤上，以促进根系生长，提高耐低温的能力。

2.2加强扰寒栽培,提高树木抗性

加强栽培管理，尤其是生长后期的管理，有助于树体内营养物质的贮备，经验证明，春季加强肥水供应，合理运用排灌和施肥技术，可以促进新梢生长和叶片增大，提高光合效能，增加营养物质的积累，保证树体健壮，后期控制灌水，及时排涝，适量施用磷、钾肥、勤锄深耕，可促使枝条及早结束生长，有利于组织充实，延长营养物质积累的时间，提高木质化程度，增加扰寒性。正确的松土施肥，不但可以增加根量，而且可以促进根系深扎，有助于减少低温伤害。

此外，夏季适期摘心，促进枝条成熟，冬季修剪，减少蒸腾面积以及人工落叶等均对预防低温伤害有良好的效果。同时在整个生长期中必须做好病虫害的防治工作。

2.3改善小气候条件,增加温度与湿度的稳定性

通过生物、物理成化学的方法，改善小气候条件，减少树体的温度变化，提高大气湿度，促进上下层空气对流，避免冷空气聚集，可以减轻低温，特别是晚霜知冻旱的危害。所以根据气象台的霜冻预报及时采取防霜冻措施，对保护树木具有重要作用，具体方法为：

（1）喷水法。利用人工降雨和喷雾设备，在将发生霜冻的黎明，向树冠喷水，防止急剧降温，因为水的温度比周围气温高，热容量大，水遇冷冻结时还会放出热，同时，喷水还能提高近地表层的空气湿度，减少地面辐射的散失，起到减缓降温防止霜冻的效果。

（2）烟熏法。法根据气象预报，于凌晨及时点火发烟，形成烟幕，熏烟能减少土壤热量的辐射散失，同时烟粒吸收湿气，使水气凝结液体放出热量提高温度，保护树木。但在多风或降温到一3℃以下时，则效果不好。

（3）根外追肥。根外追肥能增加细胞浓度，抗冻效果也很好。霜冻过后我们要做好善后工作，特别是对花灌木和果树，为了尽可能减少灾害造成的损失，应采取积极措施，如进行叶面喷肥以恢复树势等。

2.4加强树体保护，减少低温危害

对树体的保护措施很多，一般的树木采用浇…冻水…和灌…春水…防寒.冻前灌水,特别是对常绿树周围的土壤灌水,要保证冬季有足够的水分供应,为了保护容易受冻的树种,还可以采用全株培土（牡丹），根茎培土、涂白、喷白、主干包裹，设防风障。实践证明，如在树干周围撒布马粪，腐叶土或泥炭、锯未等保温材料覆盖根区，能提高土温而缩短土壤冻结期，提早化冻，有利根部吸水及时补充枝条失掉水分。

此外，在树木已经萌动，开始伸枝展叶或开花时，根外追放磷酸二氢钾，有利于增加细胞液的浓度，增强抗晚霜的能力。

三、受冻害树木的养护管理措施

受冻后树木的养护极为重要，因为受冻树木的输导组织受树脂状物质的淤塞，树木根的吸收、输导及叶的蒸腾、光合作用以及植株的生长等均遭到破坏。为此，在恢复受冻树木的生长时，应尽快恢复输导系统，治愈伤口，缓和缺水现象，促进休眠芽萌发和叶片迅速增大，促使受冻树木快速恢复生长。

3.1合理修剪。对受害植株重剪会产生有害的副作用，因此修剪中要严格控制修剪量，对受冻害树体要晚剪和轻剪，给予枝条一定的恢复期，对明显受冻括死部分可及时剪除，以利伤口愈合。对于一时看不准受冻部位的，待春天发芽后再剪，对受冻造成的伤口要及时喷涂白剂预防日烧。

3.2合理施肥。受冻后的树，一般均表现生长不良，因此首先要加强管理，保证前期的水肥供应，也可以早期追肥和根外追肥，补给养分以尽量便树体恢复生长。但实标工作中，应根据树种及受害的程度，灵活掌握施肥措施。3.3强病虫害预防.树木遭受低温危害后,树势较弱,极易受病虫害侵袭，可结合防治低温施用一些生物制病。

化学冻伤处理方法范文

关键词：红肉脐橙;玻璃化超低温;存活率

中图分类号：S666;Q813文献标识码：ADOI编号：10.14025/ki.jlny.2015.18.027

红肉脐橙（CitrussinensisL.cv.redfleshnavelorange）原名CaraCara，20世纪80年现于委内瑞拉，是华盛顿脐橙的天然芽变，到目前为止，它是在甜橙中发现的唯一果肉呈粉红色或红色的脐橙品种[1]。红肉脐橙果实闭脐，果皮橙红，着色均匀，果肉内质，果汁多，酸甜适口，有特殊香味。红肉脐橙丰产性能好，品质优良，耐储存，极具市场潜力。

玻璃化（vitruification）超低温保存植物种质资源始于20世纪80年代，Uagami等首先采用此法尝试保存石刁柏悬浮细胞和体胚[2]，随后Sakai等做了进一步改进。该方法将细胞或组织在冷冻前，用植物玻璃化溶液（plantvitrificationsolution，PVS）[3]处理，使细胞脱水并使DOMS进入细胞，使细胞在-196℃下，不形成冰晶而成玻璃化状态[4]。

在本研究中，红肉脐橙愈伤组织首先经过PVS处理后，转入到液氮中保存100分钟，用洗脱液洗去PVS后，然后检测细胞存活率。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1柑橘品种红肉脐橙愈伤组织由华中农业大学作物遗传改良实验室提供，河南大学农业生物技术研究所保存。

1.1.2所用试剂PVS（Plantvitrifitionsolation）：30%的甘油，15%的乙二醇，15%的DMSO，0.4mol/L蔗糖的液体MS培养基。

洗脱液：1.2mol/L蔗糖的MS溶液，1%TTC（氯化三苯基四氮唑）溶液，0.1mol/L，pH=7的磷酸缓冲液。

1.2方法

1.2.1红肉脐橙愈伤组织的液体悬浮培养将红肉脐橙愈伤组织转入液体MS培养基中悬浮培养，培养条件：26℃，100rpm。每周传代1次。

1.2.2超低温处理把悬浮培养的愈伤组织转入冷冻管中，每管1克愈伤组织。把材料分为4组：未处理组，对照组，A组（PVS处理10分钟），B组（PVS处理15分钟）。将对照组、A组和B组在冰水混合物中处理10～15分钟，然后放入液氮（LN）中，处理100分钟。

1.2.3细胞活性分析将冷冻管从液氮中取出，迅速放到40℃水浴锅中温浴2分钟，然后在操作台中吸去PVS溶液，加入洗脱液洗涤40分钟，中间换液3～4次。除去洗脱液，然后用TTC法检测这些愈伤组织细胞活性。

TTC法检测细胞活性：将液氮处理过的细胞转入10毫升离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液和TTC溶液各2毫升，置于37℃恒温箱中，黑暗处理1小时，后加入硫酸（1mol/L）终止反应，吸去TTC溶液和磷酸缓冲液，加入2毫升乙酸乙酯，然后转入研钵中加入少量石英沙，充分研磨，提取被脱氢酶还原后生成的红色的TTF，后把研钵中的乙酸乙酯转入石英比色杯中，再加入3毫升乙酸乙酯，在分光光度计上测量在485nm处吸光度。用这种吸收值（TTC值）表示处理愈伤组织在超低温保存后细胞的生活力。

2结果与分析

细胞存活率的计算方法：

细胞存活率=（处理后细胞TTC值/未处理细胞TTC值）×100%

表1TTC法检测结果

注：“未处理”指未用超低温和PVS处理，“对照”指用超低温处理作为对照，“处理A”指PVS处理10分钟后超低温处理，“处理B”指PVS处理15分钟后超低温处理。

由表1可知，不用冷冻保护剂（PVS）处理，存活率为0.80%，用冷冻保护剂（PVS）处理10分钟后，其存活率是1.67%。PVS处理15分钟后，其存活率为4.54%。这说明超低温处理后，细胞受到损伤，其存活率显著降低，冷冻保护剂处理能提高其存活率。

3讨论

此研究还需要进一步优化PVS脱水温度和脱水时间，降低对细胞的毒性，可以用其他复合冷冻保护剂，也可以优化超低温冷冻程序，采用慢速冷冻法等。

参考文献

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