单细胞生物总结范文篇1

[关键词]涎腺导管癌；巨细胞瘤；病理学；免疫组织化学；组织起源

[中图分类号]R739.87[文献标志码]B[doi]10.7518/hxkq.2013.03.024

以巨细胞瘤（giantcelltumor，GCT）为主要特征的原发性涎腺导管癌（salivaryductcarcinoma，SDC）是极为罕见的相对新认识的尚未完全定义组织发生学的一种肿瘤。GCT通常与另一个唾液腺原发肿瘤（如SDC、癌肉瘤等）存在关联。无痛的、不断进展的肿块是最常见的症状。本文报道1例发生于腮腺的伴有GCT的SDC，并结合文献，探讨该肿瘤的临床特点、病理学改变及组织学起源等。

1病例报告

患者男性，68岁，2011年5月以“发现左耳下肿物20多天”入院。大约20多天前，患者突然感觉左耳下不适，自己检查发现局部有一包块。无发热，否认牙痛，无外伤、手术史。专科检查：颜面部基本对称，左侧腮腺下极略膨隆，可扪及腮腺部一肿物，约2.0cm×2.0cm大小，肿块表面皮肤颜色正常，质地中等，无压痛，表面无明显分叶状，与周围组织无粘连，活动度良好；无面瘫症状；双侧髁突活动良好，张口度约二指。咬合关系良好，上颌及腭部未见异常，舌运动良好，伸舌居中；口内牙龈和黏膜颜色正常，右腮腺、双颌下腺未扪及异常，导管开口无红肿，分泌液清亮；咽部未见异常；双侧颌下及颈部淋巴结无肿大。

超声检查（图1）：左侧腮腺形态、大小如常，下极可见一个低回声肿块，大小约1.6cm×1.0cm，形状呈类圆形，实质回声不均匀，边界不规整，向周边组织呈浸润状，彩色多普勒血流显像（colorDop-plerflowimaging，CDFI）未见明显血流信号。诊断：

左侧腮腺实质性占位，恶性可能。其余影像学资料未见软组织及骨组织占位。

门诊以“左腮腺腺淋巴瘤”收入院。全身麻醉下行“左腮腺切除术”，术中见肿物位于腮腺下部，

结节状，大小1.8cm×1.5cm×1.2cm，无包膜，界尚清，切面淡黄，实性，质中，未见明显出血、坏死（图2）。手术切除面神经总干下方腮腺组织和肿瘤，结扎腮腺残端。切除标本4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片，苏木精-伊红（hematoxylin-eosinstaining，

HE）染色，光镜下观察。免疫组织化学采用EnVision

两步法，所用一抗Pan-CK、HMWCK、CK8/18、CK5/6、CK19、CK7、EMA、AR、Her-2、GCDFP-15、P53、CD68、Vimentin、Lysozyme、PSA、ER、TTF-1、CEA、CDX2均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

术后病理组织观察：在残存、萎缩的涎腺组织中，肿瘤呈现两种不同的组织结构浸润生长，以位于中心的GCT结构为主，约占肿块的80%，表现为成片单核细胞背景中均匀地散见的多核、破骨细胞样巨细胞。巨细胞特征性地有多个位于细胞中央的圆形-卵圆形泡状核（总数2～50个，平均15个），单一小核仁清晰，胞质嗜伊红。单核细胞有类似巨细胞的圆形-卵圆形泡状核，细胞大小相近，胞质弱嗜伊红（图3左）。在肿瘤周边，表现典型SDC的侵袭性、

恶性特征。GCT和SDC之间无界限，可看到移行过渡区（图3右）。无类骨质形成。

免疫组织化学：SDC细胞弥漫而强烈地表达Pan-CK（图4）、HMWCK、CK7、CK5/6、CK8/18、CK19、

EMA、AR、Her-2、GCDFP-15、P53，单核细胞以及破骨样巨细胞均表达CD68（图5）和波形蛋白，部分单核细胞还表达Pan-CK、CK5/6、EMA、P53及局灶表达溶菌酶；破骨样巨细胞不表达上皮标志物及AR、Her-2和GCDFP-15。散在的高度异型的与巨细胞相混合或被其吞噬的单核细胞也表达上皮标志物。所有的PSA、ER、TTF-1、CEA、CDX2均为阴性。

2讨论

2.1临床表现和诊断

涎腺原发性GCT是极为罕见的病理类型，组织形态类似骨巨细胞瘤。1984年Eusebi等[1]报道3例腮

腺GCT，其中1例伴腮腺癌在多形性腺瘤癌（carcinomaexpleomorphicadenoma，CXPA）中。截止目前，仅有17例涎腺GCT的报道。结合本例报道并总结文献，涎腺GCT通常与另一个唾液腺原发肿瘤存在关联，半数病例伴有癌，通常是SDC、CXPA、癌肉瘤等[2-3]。

这些病例中，15例（83%）发生在腮腺，2例（11%）发生在颌下腺，1例（6%）发生在小唾液腺[4]。患者年龄28～92岁（平均61岁），多数为男性（男女比例4∶1）。

无痛的快速进展的肿块是最常见的症状，少数病例也会缓慢生长。切除术后9个月，8例患者没有任何症状，1例颈部淋巴结转移[5]，1例死于癌播散（肺转

移）[6]。一般来说，由于SDC成分，伴有SDC的GCT相对于骨巨细胞瘤更具侵袭性。

切除标本多为涎腺内的结节状肿物，无包膜或菲薄不完整薄膜，界清，切面淡黄或灰白，质中偏软。出血、坏死多见。组织学特征：在残存、萎缩的涎腺组织中似乎有两个毗邻彼此不同的肿瘤浸润生长，两种肿瘤之间可以看到移行过渡区。一个肿瘤表现典型涎腺导管癌的侵袭性、恶性特征；另一个表现为破骨细胞样巨细胞瘤。前者主要位于肿瘤周围，有典型的腺样、筛孔状、“Roman桥”样、粉刺样坏死及实片状特征。间质见纤维化和炎症细胞浸润，可见血管和神经浸润。导管癌细胞由高核浆比的非典型上皮细胞构成，细胞异型性大，泡状核，核仁显著，含丰富粉红色颗粒状细胞质，嗜酸细胞化生常见。后者GCT成分占肿块的60%～80%，表现为成片单核细胞背景中均匀地散见的多核、破骨细胞样巨细胞。巨细胞特征性的有多个位于细胞中央的圆形-卵圆形泡状核，核染色质均匀、细腻，单一小核仁清晰，胞质嗜伊红。单核细胞有类似巨细胞的圆形-卵圆形泡状核，细胞大小相近，胞质弱嗜伊红。在邻近涎腺导管癌的移行过渡区，高度异型的单核和多核瘤细胞与巨细胞瘤相混合，部分细胞甚至被破骨细胞样巨细胞所吞噬。在部分区域，涎腺导管癌和巨细胞瘤由纤维组织分隔，另外的区域可看到似乎已融合，二者间无清晰的边界。间质血管丰富、出血、多灶性坏死。无类骨质形成。免疫组织

化学染色：SDC细胞一般强表达上皮标志物（EMA，CK系列）和AR、Her-2、GCDFP-15、P53；单核间

质细胞及破骨样巨细胞表达CD68、波形蛋白、P53、溶菌酶，部分尤其邻近SDC的单核间质细胞还表达Pan-CK、EMA等上皮标志物；破骨样巨细胞不表达GCDFP-15、AR和Her-2。散在的、高度异型的与巨细胞相混合或被其吞噬的单核细胞也表达上皮标志物。所有成分的ER、TTF-1、CEA、CDX2均为阴性，PSA一般为阴性，少数SDC阳性，这有助于排除转移性癌。涎腺GCT中的一些单核细胞对组织细胞和上皮标志物均有反应[1-8]。由于涎腺GCT多伴有各种癌性成分，诊断涎腺GCT时，所有的标本必须仔细检查，多处取材非常必要，并辅以免疫组织化学验查。

2.2起源

过去一度认为，涎腺原发性GCT与骨巨细胞瘤同源，但最近的一项研究[7]认为，其更像是癌。近来，基于具有和骨巨细胞瘤不同的p53基因位点的杂合性

缺失和微卫星不稳定性，Tse等[7]认为涎腺GCT是与

骨巨细胞瘤无关的肿瘤实体而不是反应性病变。然而，尚不清楚这种肿瘤是否是一个不寻常的化生癌或者起源于间质或干细胞。虽然涎腺原发性GCT与骨巨细胞瘤形态上相似，但还是有一些特征可以使之区别于骨巨细胞瘤和其他骨外的巨细胞瘤。例如，涎腺肿瘤更具生物学侵袭性，多有癌性成分，在近移行过渡区可见散在的、明显的恶性上皮细胞与单核细胞成分混合，外周不见与之相关的反应性骨形成，临床及影像学检查也容易将侵入腮腺的颌骨骨巨细胞瘤排除。一些对涎腺GCT的超微结构的研究也观察到：虽然巨细胞有类似于骨破骨细胞的特征，但单核细胞有很多微绒毛和一些细胞-细胞间接合部；单核细胞细胞质局灶性表达溶菌酶，而骨或癌组织的巨细胞不表达[6]。Nagao等[8]报道1例SDC伴肉瘤样区域及GCT样组织结构，认为涎腺GCT可能是癌肉瘤。原因如下：涎腺GCT共存癌性区域非常多见；涎腺GCT的单核细胞没有明显的恶性特点，但有一定程度的核异型性；如同SDC成分一样，涎腺GCT的单核细胞表达p53，都有肿瘤特征；单核细胞除表达组织细胞外，还表达上皮标志物如Pan-CK和EMA；许多所谓的组织细胞标志物没有特异性，在非组织细胞中也表达。Tse等[7]报道SDC成分和GCT成

分具有类似的基因表型。本文病例也显示了癌和单核细胞的混合和移行过渡，涎腺GCT可能从SDC转分化而来，因此涎腺GCT可能是SDC的肉瘤样变异。

2.3鉴别诊断

对癌肉瘤或肉瘤化癌来说，上皮和间叶细胞均异型性明显，核分裂像多见，间叶成分多表现为梭形细胞，其组织结构及形态多样，免疫组织化学分别表达上皮及间叶标志物。病史、有无外伤、手术史、无局部炎性肿痛有助于除外涎腺巨细胞肉芽肿及反应性的异物巨细胞，虽然涎腺巨细胞肉芽肿也常与肿瘤相关，但其不表达上皮标志物和p53。本文病例表达p53、Pan-CK、EMA，是肿瘤而不是巨细胞肉芽肿[2]。原发于涎腺软组织的巨细胞瘤极为罕见，通常

不伴有癌性成分（如典型SDC），而且一般不表达上皮标志物（如Pan-CK、EMA等）。涎腺未分化癌巨细胞一般为瘤巨细胞，异型性明显，核仁显著，核分裂像多，可有明显的梭形细胞成分，免疫组织化学上巨细胞和梭形细胞都表达上皮标志物。病史、组织形态及辅助免疫组织化学检查一般可有效鉴别转移性癌。

2.4治疗和预后

手术切除是涎腺GCT主要的治疗手段，广泛彻底地切除肿瘤是提高生存率的关键，但对放、化疗方案及疗效尚无统一意见。研究[4-5，8]表明：以巨细

胞瘤为特征的涎腺癌仅有13%的病例直接死于肿瘤，死亡原因主要为远处转移。

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[8]NagaoT，GaffeyTA，SerizawaH，etal.Sarcomatoidvariantof

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单细胞生物总结范文

从心脏泵出、流动在全身血管内的血液由有形成分（细胞）和无形成份（液体）组成。有形成份占血液的45％，包括红细胞、白细胞和血小板等，其余55％为无形成分是呈液体流动的血浆。针对细胞学检查是血常规。针对血浆的检查包括各种物质定量的血生化检查、免疫学检查和肿瘤标志物、激素、微量元素、血流变学等检查。

目前用血常规仪检查包含18项，其中关于红细胞7项、白细胞7项、血小板4项。

红细胞是人体的呼吸细胞，呈双面凹陷的圆盘状，没有细胞核，细胞质内也没有细胞器。而有大量血红蛋白，具有与氧和二氧化碳结合的能力。血液的颜色就是由血红蛋白决定的。红细胞通过血红蛋白供给全身组织代谢活动所需要的氧，并带走组织内所产生的二氧化碳。

针对红细胞的检查主要是红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）定量、红细胞压积（HCT）等三项。红细胞计数和血红蛋白定量的减低提示可能为贫血，增高则提示为红细胞增多症。红细胞压积指红细胞在血中所占体积的百分比，主要用于创伤、休克、大手术后血容量评价。平均红细胞容积（MCV）、平均红细胞血红蛋白（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）是经过上述检测数据计算的“红细胞平均指数”，作为分辨贫血类型的参考指标。如果没有发生贫血则意义不大。红细胞体积分布宽度（RDW）是红细胞容积大小的变异范围，作为贫血的参考指标。因此红细胞检查主要用于检查是否贫血。

针对白细胞的检查主要是白细胞总数（WBC）和各类白细胞的计数绝对值及百分比。白细胞是人体的防御细胞，能以变形运动穿过毛细血管壁进入周围组织吞噬并分解外来微生物和衰老、死亡的组织细胞，或成为免疫细胞，防御或消灭入侵机体的细菌、病毒和毒素。白细胞根据染色特点又分为5种类型：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴粒细胞和单核细胞。白细胞的7项包括白细胞总数、中性粒细胞（GRAN）、淋巴细胞（LYM）、单核细胞（MON）的细胞计数和百分比。白细胞总数的增加或减少，需结合白细胞分类计数和百分比，作为判定是否有感染的发生及其类型。如果白细胞总数偏高，而且中性粒细胞计数和百分比也增高，大多为细菌性感染。如果白细胞总数偏低或正常，而淋巴细胞计数和百分比增高，大多为病毒性感染。如果白细胞总数增高过多或出现幼稚细胞则可能为白血病。其中中性粒细胞计数（GRAN）的增加或减少与白细胞总数大体同步。

针对血小板的检查有4项，包括血小板计数（PLT）、平均血小板容积（MPV）、血小板压积（PCT）、血小板体积分布宽度（PDW）。血小板是止血生理过程的重要因子。未激活的血小板与其它血细胞一样在血管里流动，但当血管受损时，血小板通过激活、聚集、粘附红细胞形成血凝块，实现止血、凝血功能。血小板计数过低时可能有出血倾向，再生不良性贫血。增高时提示高凝状态，可能与红细胞血球增多症、慢性骨髓性白血病、骨髓纤维化、脾脏切除等有关。平均血小板容积是对单个血小板平均容积大小、血小板压积是血小板占全血的容积百分比、血小板体积分布宽度是血小板体积大小的分布范围，这三项是协助评定血小板功能的检查项目。

单细胞生物总结范文篇3

1教材分析及设计思路

“水中的藻类植物”是苏科版七年级下册第十章第二节的内容。这部分内容看似简单，却起着承上启下的作用，尤为重要。一方面，它是继第一节“水中的动物”之后对水中生物的继续研究；另一方面藻类植物特征的学习又为下一章“地面上的植物”作了很好的铺垫。

教材从生活在海洋中的藻类――海带和紫菜出发，并通过水绵的观察实验概述出藻类植物的主要特征，最后以举例的方式概述藻类植物与人类生活的关系。此部分内容较少，但学生对于藻类植物的主要特征理解起来比较抽象，因此设计了以下活动来促进学生学习：

①加入了对几种藻类标本以及实物的观察，更直观地展示出藻类植物特征。

②在观察水绵实验中加入了对水绵永久装片的观察和另一种藻类刚毛藻的比较观察、对水绵染色后细胞核的观察以及水绵模型的制作。

③学生演绎“藻类植物大聚会”的小品。

2教学目标

2.1知识目标

综合观察比较几种常见的藻类植物概述藻类植物的主要特征；通过观察实验和模型制作，说明水绵细胞的结构特点；结合生活实际和小品活动，概述藻类植物与人类的关系。

2.2能力目标

熟练观察技能，尝试完成“观察水绵”“制作水绵模型”的活动，在活动中提高观察、实验动手能力。

2.3情感、态度与价值观目标

通过一系列学生活动，培养观察、实验、建构模型、探求知识的精神和合作精神；通过小品“藻类植物大聚会”关注藻类植物的生存状况，形成自觉保护生态环境的意识。

3教学重难点

3.1教学重点

概述藻类植物的主要特征。

3.2教学难点

进行“观察水绵”的活动，阐述水绵的结构特点。

4教学准备

教师制作多媒体课件，布置学生课前预习。教师准备紫菜、海带、石花菜、羊栖菜4种海藻；准备“观察水绵”实验的材料用具；准备制作水绵细胞模型的材料用具；编好小品“藻类植物大聚会”的台词。

5教学过程

5.1情境创设引入

学生观察衣藻的模型，观看衣藻的相关视频。教师引导学生回忆之前学过的衣藻的生活环境和结构特征，阐述衣藻就属于水中的一种藻类植物，从而激发学生学习本节内容的强烈欲望，从而引出课题――水中的藻类植物。同时教师提出问题：藻类植物都像衣藻那样微小吗？藻类植物有根、茎、叶等器官吗？藻类植物的生活环境都和衣藻一样吗？藻类植物含有叶绿素吗？能进行光合作用吗？（通过观察细胞结构阐明）藻类植物对人类有益处吗？越多越好吗？

5.2概述藻类植物

学生活动一：观察各种藻类植物的标本，以及课前准备好的海带、紫菜、羊栖菜、石花菜几种藻类植物。结合书本P55和海带的相关视频，学生思考：藻类植物都像衣藻那样微小吗？藻类植物含有叶绿素吗？能进行光合作用吗？藻类植物有根、茎、叶等器官吗？藻类植物的生活环境都和衣藻一样吗？这样概述藻类植物主要特征。

教师活动：边设问边引导学生补充海藻的概念，简单介绍褐藻、红藻、绿藻的分类。简单阐述制作藻类植物的几个部分切片。与学生共同总结藻类植物主要特征：大部分藻类植物含叶绿素和其他辅助色素，能进行光合作用；藻类植物没有根、茎、叶等器官的分化；藻类植物大多生活在水中，其中衣藻、小球藻是生活在淡水中的单细胞藻类，海带和紫菜是生活在海洋中的多细胞藻类。

活动意图：让学生直接观察各种藻类及标本更直观，结合视频和教师阐述更具体，师生能达成共识，初步了解藻类植物的主要特征。

教师提出问题：下面要登场的是今天的主角――水绵，水绵是单细胞还是多细胞的藻类？水绵生活在哪里？我们以前接触过水绵吗？还记得恩吉尔曼的实验吗？水绵的形态结构尤其是其中的叶绿体真的长得像恩吉尔曼观察到的那样吗？

设计意图：通过一系列问题及对证明光合作用场所实验的回顾，使学生初步了解水绵，激发学生的学习兴趣，自然地过渡出下一部分内容。

5.3观察水绵

学生活动二：通过图片了解水绵的生活环境，观察水绵，思考：水绵的颜色和形状如何？用手触摸水绵，有什么感觉？水绵是单细胞生物还是多细胞生物？水绵每个细胞形态、结构如何？水绵有没有叶绿体，什么形状，怎样排列？水绵有根、茎、叶等器官吗？

5.3.1熟悉显微镜的使用，观察水绵的永久装片

学生回顾显微镜的使用步骤。教师强调对光的注意事项及先用低倍镜观察再用高倍镜观察的原则。学生观察水绵永久装片。

设计意图：对水绵永久装片的观察为接下来分辨水绵作好铺垫。

5.3.2学生制作临时装片

学生完成活动单上制作藻类临时装片的方法步骤。活动单部分示意：

取取一片洁净的___________

滴在载玻片的中央滴一滴__________。

夹用镊子夹__________藻类，放在水滴中，并分开展平。

盖盖上__________。

两个学生一组，分别从1号、2号烧杯中取藻类制作成临时装片，观察后判断1号烧杯中的是水绵，2号烧杯中的是另一种藻类（刚毛藻）（图1、图2）。

教师活动：教师指导学生进行显微镜的操作，同时选取一些学生制做的临时装片并通过数码显微镜呈现，引导全班学生讨论。学生最终找出水绵，判断1号烧杯中是水绵的依据是其细胞有典型结构特点：绿色、带形、螺旋状的叶绿体。

设计意图：通过水绵与另一种藻类细胞结构的观察、比较，既直观看到了水绵细胞的叶绿体结构特点，又剖析了难点，学生通过自主探究，印象更加深刻。

5.4.3观察水绵的细胞核

学生用碘液染色，进一步观察水绵的细胞结构――细胞核。

设计意图：这样既深入了解了水绵细胞的其他结构，又剖析了难点。

5.4.4水绵细胞的结构

学生说出水绵细胞各部分的结构名称，完成活动单（见图3）。

教师活动：教师指导学生说出水绵细胞各部分结构。

设计意图：以学生为主体，师生共同剖析难点。

5.4.5实验总结

学生讨论交流完成活动单。活动单部分如下所示：

水绵是一种__________色呈丝状的淡水藻类植物，用手触摸有黏滑的感觉。

水绵是__________（单/多）细胞藻类，每条水绵由许多结构相同的长筒状细胞连接而成。水绵__________（有/没有）根、茎、叶等器官的分化。

水绵细胞中有__________状的叶绿体，能进行__________制造有机物。

教师活动：指导学生一一填写，并板书总结藻类植物的主要特征。

设计意图：讲练结合，既是“观察水绵”这一活动的总结，也是本节的一个总结。这样既剖析了难点，又突出了重点。

5.5制作水绵细胞模型

学生活动三：利用教师课前准备好：塑料盒、保鲜膜、绿纸条、白色小球、剪刀等材料，两个学生一组，各显身手，制作水绵细胞模型。

教师活动：将学生做好的模型实物投影展示，师生共同交流，强调水绵叶绿体的典型结构。对做的又快又好的一组同学进行奖励。

设计意图：所谓在学中做，在做中学，通过模型制作这个拓展活动，既剖析了难点，又锻炼了学生的动手能力，充分调动了学生学习生物的积极性。同时对学生的奖励也是为引出下面的内容做好铺垫。

5.6藻类植物与人类的关系

学生活动三：学生代表表演小品“藻类植物大聚会”。原创台词如下：

藻类植物大聚会

紫菜：大家好，我是紫菜。今天是我的生日，家里来了很多的亲戚，可热闹了！

海带：我是海带，祝你生日快乐！水绵让我带了礼物给你。

紫菜：水绵为什么自己不来？

海带：他虽然是我们的亲戚，但他在淡水中，来不了。

紫菜：哦，我怎么忘了。还想让他给我清热解毒来着。对了，那小球藻和衣藻也来不了了哦，他们含的蛋白质可多了。

海带：没关系，有我啊，我的作用大着呢。我可以食用，还含有丰富的碘，可以预防“地方性甲状腺肿大”。

紫菜：什么是“地方性甲状腺肿大”？

马尾藻：我知道我知道，就是“大脖子病”。我是马尾藻，我和海带都属于褐藻家族，我们的作用可大了，可以从我们身上提取褐藻胶和甘露醇制药、工业用、造纸用等。我还能做饲料和肥料，用处说一夜都说不完啊！

石花菜：我来了，我来了。马尾藻，你就别嗦了，我是石花菜。紫菜，祝你生日快乐！猜猜我给你带了什么礼物？

紫菜：你也是我的亲戚吗？

石花菜：气死我了，你连我都不认识了，我和你可都是红藻家族的呀，我们都可以食用，味道可鲜美了！

紫菜：哦，想起来了，你肯定也和我们一样都没有根、茎、叶。

石花菜：是啊，是啊。我身上还能提取琼脂用来做果冻呢。猜出来我给你带的是什么礼物了吧。

紫菜：肯定是果冻吧。

石花菜：答对了。

海带：紫菜，我看大家都来的差不多了，要不我们就开始生日宴会吧。

紫菜：好的。让我们一起来尽情享受阳光，发挥我们最大的功效――光合作用制造氧气吧。

大家一起说：好啊，好啊，最好再把这里的水质改善改善。

马尾藻：我看大家聚一聚就赶紧散了吧，去给鱼类做饵料，不然我们这么多藻类一直聚在一快可不得了。石花菜，你说是吧？

石花菜：是啊，我们太多，繁殖的太快对人类可就没那么多好处了，对了，人们管那叫“赤潮”还是“水华”来着？

紫菜：是“水华”。

海带：是“赤潮”。

紫菜：“水华”。

海带：“赤潮”。

紫菜：“水华”。

海带：“赤潮”……

教师活动：组织学生表演。引导学生总结藻类植物与人类的关系，简单讲解“赤潮”与“水华”的区别。安排学生课后查阅有关资料，了解引发海洋“赤潮”或湖泊“水华”的原因及治理办法，为下节课的交流与探讨做准备。

设计意图：用小品活动代替简单枯燥的呈现，使课堂气氛相对活跃，同时既很好地道出藻类与人类的关系，又强调了藻类的一些主要特征，是一个总结性的收尾。

5.7板书设计（略）

单细胞生物总结范文篇4

中图分类号：R733.7

文献标识码：A

文章编号：1007-2349(2008)02-0044-02

人参始载于《本经》，味甘、苦，性平，入脾、肺、心经，传统中医学认为人参具有大补元气、补脾益肺、生津止渴、安神益智、补气生血的作用。在祖国医学中应用广泛，历史悠久，《神农本草经》把人参列为上品，有“主补五脏、安精神、止惊悸、除邪气、明目、开心益智”的记述。人参在临床上有重要功能，在很多方剂中列为君药。人参的主要有效成分为人参皂苷，按单体皂苷元所含羟基量不同分为人参二醇和人参三醇两大类。近年来已有研究报道人参皂苷能抑制白血病细胞增殖、促进凋亡、诱导分化、增加化疗药物的敏感性和逆转耐药等作用，本文就近年来该方面的研究进展作一综述。

1、抑制白血病细胞增殖、促进凋亡、诱导分化

高瑞兰等采用白血病祖细胞集落形成(CFU-AML)培养法，观察不同浓度人参总皂苷对HL-60、Meg-01白血病细胞株和急性髓细胞白血病患者的骨髓细胞集落形成的影响，并以正常粒单祖细胞(CFU-GM)作比较，结果示TSPG对白血病祖细胞的影响不同于正常的细胞，不同的浓度显示为增殖或抑制的双向作用。陈地龙等采用细胞体外培养技术，MTT法检测细胞增殖抑制，光镜和电镜观察细胞形态变化；联苯胺、糖原染色、过氧化物酶、非特异性脂酶细胞化学染色分别检测K562细胞向红系、粒系、巨核系分化的特征；免疫细胞化学检测细胞表面分化抗原及因子表达；FAS及FAS-L等检测细胞凋亡情况。证明人参多糖(GPS)能明显抑制K562细胞增殖并能诱导其凋亡并使K562细胞向成熟方向分化。戴勤等采用造血细胞体外培养形态学观察免疫细胞化学流式细胞术等实验血液学技术证明GPS可能通过阻止HL～60细胞从静止期GO期进入增殖周期S/G2+M期抑制DNA的合成等途径进而抑制细胞的增殖，提示GPS有可能成为既能促进正常造血又能抑制人白血病等肿瘤细胞增殖的天然诱导剂。李勇等通过四唑盐比色法观察细胞生长，蛋白印迹法和反转录一聚合酶链反应分析G-Rb1对细胞的GR蛋白和GRamRNA的改变。发现G-Rb1可上调HL-60细胞GRamRNA及GR蛋白的表达并抑制细胞生长。李世辉等利用MTT法检测细胞增殖抑制作用；流式细胞术检测SP2/0细胞凋亡率及细胞周期；常规Giemsa染色和DAPI荧光染色后观察SP2/0凋亡细胞的形态学变化；酶联免疫吸附法测定药物干预前后细胞上清液中肿瘤坏死因子、巨噬细胞炎症蛋白-let的水平。结果示G-Rh对SP2/0骨髓瘤细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用，且这种作用有周期特异性。曹唯希等采用图像分析术、流式细胞术、形态学观察与免疫细胞化学等方法，研究人参总皂苷诱导K562细胞凋亡。发现人参总皂苷对K562细胞有增殖抑制作用，并可诱导K562细胞凋亡明显增加，同时细胞Fas表达升高。且推论人参总皂苷能诱导K562细胞凋亡，其机制可能与调控Fas表达升高有关。牛泱平等取不同浓度的GS处理HL-60细胞，通过观察细胞形态学的变化；流式细胞术分析细胞DNA含量的改变，并进行DN段分析；AnnexinV-FITC试验法分析细胞凋亡百分率。结果示人参皂苷能够抑制HL-60细胞生长，在一定剂量和时间范围内可引起细胞凋亡，可为临床应用人参皂苷作为化疗药物的辅助剂治疗白血病提供实验依据。李朝晖采用MTT法测定药物对细胞的抑制率，细胞形态学观察细胞分裂及凋亡，流式细胞仪进行细胞周期分析，发现人参皂苷Rg1呈剂量依赖性的将细胞阻滞于G1期，使G1期不能运行到S期，从而影响了肿瘤细胞的有丝分裂，并且在低于GO/G1期出现典型的凋亡峰。细胞形态学观察可见分裂细胞以及凋亡细胞。陈小红等选用人T淋巴细胞株(Jurkat细胞)作靶细胞，采用MTT法和半固体集落培养法观察不同浓度的GS对Jurkat细胞增生的抑制效应；用Annex-inV-FITC试验法分析Jurkat细胞的凋亡百分率，并进行DN段分析。证明GS在一定浓度范围内可抑制Jurkat细胞增生，并能够诱导其凋亡，为临床应用提供理论依据。陈地龙等采用细胞体外培养技术，光镜和电镜观察细胞形态变化；联苯胺染色、POX染色、α-NAE细胞化学染色发现TSPG协同细胞因子对K562细胞的诱导作用与TSPG单独作用相比，K562细胞形态学更趋向于成熟；血红蛋白、过氧化物酶的表达明显增加；细胞表面分化抗原CDl5、HIR2、EPO-R、GM-CSF-R的表达明显增强。方美云等应用光学和电子显微镜观察细胞的形态学特征，单克隆抗体标记流式细胞术检测细胞表型，用ELISA法测定L-60-DC培养上清液中的IL-12及INF-7的量，用流式细胞仪检测凋亡率。结果HL-60细胞在组合细胞因子并分别加入TSPG及As2o3后，均可诱生出不同比例的DC。光镜及电镜下均有典型的树突状细胞的形态学特征，细胞表达DC的表面分化抗原，诱生的DC培养上清液中可测出不同量的IL-12及IFN-7。联合中药各组的凋亡率、树突状细胞的特异性抗原表达均高于GM-CSF与IL-4组。诱生后的DC具有抗白血病细胞作用，与HL-60细胞共培养后可使白血病细胞凋亡明显增强。

2、对白血病细胞的其他作用

高瑞兰等ElZ3采用白血病组细胞集落形成(CFU-MAL)药敏试验法。选用4种化疗药物：高三尖杉酯碱、阿糖胞苷、阿霉素和足叶乙苷。通过观察其集落生长情况发现人参总皂苷可使常规的化疗药物对白血病细胞的抑制作用增强。王一等采用PCR-ELISA法检测端粒酶性，Southernblot法检测端粒长度，观察到经人参皂苷、三氧化二砷及β榄香烯作用后，K562细胞株端粒酶活性下降，下降程度呈浓度、时间依赖性，在一定浓度及作用时间后端粒酶呈阴性；细胞的存活率下降；并推论抑制端粒酶活性可能是其抗肿瘤作用的机制之一；其后王一等用不同浓度的三氧化二砷、人参皂苷及β榄香烯单独及联合环磷酰胺与人类白血病细胞株K562共培养，采用PCR-ELISA法检测端粒酶活性、Southern杂交法检测端粒长度。观察到三氧化二砷、人参皂苷、β榄香烯及环磷酰胺均能抑制K562细胞株的生长及端粒酶活性，抑制端粒酶活性可能是其抗肿瘤作用的机制之一；三氧化二砷、人参皂苷、β榄香烯与环磷酰胺联合应用后抑制作用增强；联合环磷酰胺可望降低上述药物的给药浓度。周烨等运用基因芯片技术研究人参总皂苷(TSPG)作用后K562细胞基因表达谱的变化，结果示TSPG刺激K562细胞后共有362个基因表达发生变化，与对照组K562细胞比较，表达上调的基因有20个，主要有代谢相关基因，信号转导相关基因，细胞受体相关基因等；表达下调的有342个，包括免疫防御相关基因，DNA结合与转录因子，代谢相关基因，细胞周期相关基因等。RT-PCR技术验证了FOSL1、E2F2、CCNE2和ODZ14个基因表达的变化。证明TSPG刺激K562细胞后，影响了细胞内一系列基因的表达。这些基因可能与TSPG的抗肿瘤机制有关。陈小红等选用K562/VCR、K562/Adr两耐药细胞株作为靶细胞，液体培养和半固体集落培养法及MTT法观察到GS通过提高耐药细胞对化疗药物的敏感性而与化疗药物起协同作用，同时在一定浓度下，能直接抑制白血病耐药细胞增殖。立彦等通过细胞毒试验、药敏试验、RT-PCR方法与流式细胞术了解中药人参皂苷Rb1的毒性、细胞对药物的敏感性及在细胞水平和分子水平对多药耐药的逆转作用。结果显示人参皂苷Rb1能部分逆转耐药；RT-PCR结果显示，对照组和给药组均有明显的扩增片段区带，流式结果显示Pgp的表达无明显差异。说明可以通过人参皂苷Rb1抑制Pgp的功能，从而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，对于今后研究和发展肿瘤治疗来说有十分重要的意义。

单细胞生物总结范文1篇5

【亚硒酸钠；p38丝裂原活化蛋白激酶；单核细胞趋化蛋白1；系膜细胞；糖尿病肾病

【中图号R587.24

0引言

近年来国外探究表明单核细胞趋化蛋白1(monocytechemoattractantprotein1，MCP1)和糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）有密切关系［1］.p38MAPK是细胞信号传递的交汇点或共同通路［2-3］，但它在DN发生中的功能及其和MCP1关系仍不十分清楚；硒是机体必需微量元素之一，其缺乏可加剧DN的氧化应激，并可产生拟高血糖病理状态，从而加剧DN的发生发展［4］.但其是否功能于p38MAPK和MCP1国内外未见文献报道.我们分别给予高葡萄糖(HG)、高胰岛素(HI)、过氧化氢(H2O2)和糖基化终末产物(AGEs)孵育HBZY1细胞，观察HBZY1细胞p38MAPK和MCP1的表达以及亚硒酸钠对HBZY1细胞p38MAPK和MCP1表达的影响.从而明确二者在DN形成中的功能及硒在防治DN中的功能机制.

1材料和方法

1.1材料大鼠肾小球系膜细胞系（HBZY1，中国典型培养物保藏中心CCTCC）；新生牛血清、RPMI1640培养液、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（二抗）（北京中山生物技术有限公司）；亚硒酸钠(KarolinskaInstitute赠予)；柱离心式总RNA抽提试剂盒、RTPCR两步法试剂盒、PCR相对分子量标准（TaKaRa公司）；PCR引物合成（上海博亚生物技术有限公司），蛋白质相对分子量标记物（BioRad公司）；磷酸化p38MAPK兔多抗（(Promega公司).

1.2方法

1.2.1细胞系HBZY1的培养HBZY1细胞常规培养于200mL/LRPMI1640培养液中，培养条件为37℃，饱和湿度50mL/LCO2，每2~3日用0.2g/L乙二胺四乙酸（EDTA）消化传代.HBZY1细胞长满培养瓶底40%后分为9组，以无血清培养液饥饿24h,然后按实验分组加入刺激（及干预）因素.

1.2.2体外制备AGEs参考文献［5］，按牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）50g/L，和葡萄糖90g/L，0.5mmol/LEDTA及0.2mmol/LPBS（pH7.4）混匀后过滤除菌，37℃恒温培养箱卵孵育60d.0.1mol/LPBS（pH7.4）中透析48h，测定蛋白含量及荧光强度，分装后存于-80℃冰箱保存备用.

1.2.3实验分组分别以一定浓度HG,HI,H2O2和AGEs刺激细胞系HBZY1一定时间；先给予亚硒酸钠100nmol/L预处理HBZY1细胞48h后，再分别以上述4种刺激因素（浓度、时间同前）孵育HBZY1细胞，同时设对照组.分组情况如下摘要：①对照组摘要：用等体积PBS培养细胞;②HG组摘要：用25mmol/L葡萄糖刺激HBZY1细胞72h;③HI组摘要：用100nmol/L胰岛素刺激HBZY1细胞24h;④H2O2组摘要：用100μmol/LH2O2刺激HBZY1细胞1h;⑤AGEs组摘要：用100mg/LAGEs刺激HBZY1细胞6h;⑥亚硒酸钠+HG组摘要：依次以100nmol/L亚硒酸钠和25mmol/L葡萄糖分别刺激HBZY1细胞48h和72h;⑦亚硒酸钠+HI组摘要：依次以100nmol/L亚硒酸钠和100nmol/L胰岛素分别刺激HBZY1细胞48h和24h;⑧亚硒酸钠+H2O2组摘要：依次以100nmol/L亚硒酸钠和100μmol/LH2O2分别刺激HBZY1细胞48h和1h;⑨亚硒酸钠+AGEs组摘要：依次以100nmol/L亚硒酸钠和100mg/LAGEs分别刺激HBZY1细胞48h和6h.

1.2.4RTPCR法检测MCP1mRNA表达以柱离心式总RNA抽提试剂盒提取细胞系HBZY1总RNA，测定总RNA浓度，计算纯度，A260nm/A280nm均在1.8～2.0之间.MCP1引物序列按文献［6］摘要：上游引物摘要：5′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′；下游引物摘要：5′AGAAGTGCTTGAGGTGGTTGTGGAAAAGAG3′，扩增片段长度258bp.βactin引物序列摘要：上游引物摘要：5′TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC3′;下游引物摘要：5′TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG3′，扩增片段长度228bp.以两步法RTPCR试剂盒进行反转录扩增，扩增条件摘要：94℃变性30s，55℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环，72℃最后延伸7min.每次PCR反应至少重复3次.PCR产物于15g/L琼脂糖凝胶电泳，结果经图象分析系统扫描存图，并对目的条带进行密度分析.

1.2.5Westernblot法检测p38MAPK蛋白表达培养的细胞系HBZY1，经4℃胞浆蛋白提取液裂解，提取物在冰上孵育2h，然后12000g4℃离心10min，沉淀加入4℃预冷白提取液，震荡混匀，冰浴1h，再12000g4℃离心30min，取上清为白，其蛋白浓度经考马斯亮蓝法定量.磷酸化p38MAPK表达量采用Westernblot法检测，白中加入等体积2×上样缓冲液煮沸5min.进行10mol/LSDSPAGE，将蛋白转至PVDF膜后用5g/LBSA室温下封闭2h，分别用1∶2000抗磷酸化p38MAPK兔多抗4℃孵育过夜，用PBS充分洗涤，再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG1∶5000，37℃孵育1h，用PBS充分洗涤，DAB显色试剂盒显色.结果经图象分析系统对目的条带进行扫描存图并进行密度分析.

统计学处理摘要：资料采用SAS8.0进行统计分析，组间两两比较用非参数统计分析，P%26lt;0.05即认为有统计学差异.

2结果

2.1细胞系HBZY1MCP1mRNA表达细胞系HBZY1MCP1mRNA表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分析，HG，HI，H2O2和AGEs均可作为独立因素使细胞系HBZY1MCP1mRNA表达量均明显增加（P%26lt;0.01，表1，图1）.

表1各组细胞系HBZY1MCP1RTPCR和磷酸化p38MAPKWesternblot半定量结果（略）

2.2细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表达细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分，HG，HI，H2O2和AGEs均可作为独立因素激活p38MAPK，使细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表达明显增加（P%26lt;0.01，表1，图2）.

图1RTPCR法检测各组细胞系HBZY1MCP1mRNA和βactinmRNA表达（略）

图2Westernblot法检测各组细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白和βactin蛋白表达（略）

2.3细胞系HBZY1MCP1mRNA表达细胞系HBZY1MCP1mRNA表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分析.亚硒酸钠预处理后，再分别给予以上4种刺激因素孵育细胞系HBZY1，可见MCP1mRNA表达量分别较相应未经亚硒酸钠预处理各组明显减少（P%26lt;0.01，表1，图1）.

2.4细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表达的影响HBZY1细胞磷酸化p38MAPK蛋白表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分析.先以亚硒酸钠预处理细胞系HBZY1后，再分别给予上述4种刺激因素刺激细胞系HBZY1，可见磷酸化p38MAPK蛋白表达量分别较相应未经亚硒酸钠预处理各组显著减少（P%26lt;0.01），但和对照组比较仍有显著差异（P%26lt;0.01，表1，图2）.

3讨论

本探究结果显示HG,HI,H2O2和AGEs均可单独诱导细胞系HBZY1，使其MCP1mRNA表达量明显增加.4种刺激素诱导HBZY1细胞MCP1mRNA表达增加的机制，结合文献和实验结果我们认为有以下几点摘要：①高糖有直接刺激MCP1mRNA及蛋白表达增高的功能，该功能是PKC，MAPKs所介导，这可能是DN时肾小球中单核巨噬细胞浸润的重要原因;②大量AGEs可以和系膜细胞上的AGEs受体（RAGE）相互功能，使IκB磷酸化而导致NFκB激活；新近的探究表明［8］，AGEs和AGEs受体（RAGE）相互功能可消耗细胞内谷胱甘肽，产生大量的氧自由基，从而导致细胞内信号传导改变，激活核转录因子NFκB/AP1.同时NFκB也是调节RAGE表达的一个启动子，它的位点1和位点2的激活可使RAGE表达上调，NFκB的激活作为一种正反馈，又进一步促进了AGEs和RAGE的结合，导致NFκB的持续活化，而活化的NFκB可以上调MCP1mRNA和蛋白表达，从而在糖尿病所致肾脏损害中发挥重要功能;③过氧化氢可导致系膜细胞氧化应激加剧，诱导细胞内ROS产生，从而迅速激活NFκB，上调MCP1表达，在DN发生发展早期起重要功能［8］;④HI可能是通过激活PKC，MAPKs信号通路，引起系膜细胞氧化还原状态发生变化，使细胞内ROS产生增加，导致NFκB激活，从而使MCP1表达上调.

MCP1介导糖尿病肾小球损伤.MCP1不仅对血液中单核细胞有很强的趋化活性，也能通过激活转录因子NFκB和AP1来诱导非炎症细胞产生细胞因子和黏附分子，在诱导单核细胞迁入内皮下间隙及渗入肾小球的过程中起重要功能［7-8］；同时，渗入到肾小球的单核巨噬细胞反过来又刺激局部肾小球细胞，在巨噬细胞衍化生长因子如PDGF和TGFβ等功能下导致系膜增生和细胞外基质聚集；此外通过炎症细胞因子功能，还可上调黏附分子和趋化因子的分泌，从而进一步有利于白细胞渗入到肾小球［7］.近年来通过细胞实验及对人和实验动物DN的探究发现，MCP1在DN的发病机制中起重要功能.

p38MAPK可被多种细胞外刺激激活，导致细胞生长、增殖、分化和调控某些因子表达［9-11］.本探究以糖尿病时存在的4种应激因素孵育大鼠肾小球系膜细胞系HBZY1，可见p38MAPK被激活，磷酸化表达增加.

硒是机体必需微量元素之一，是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成部分，缺硒可出现拟高血糖症病理状态，引起白蛋白尿和肾小球硬化，从而加剧DN的发生发展；补充硒不仅可预防氧化应激，而且可防止肾脏损伤［4,12］.本探究结果还显示，亚硒酸钠具有类似p38MAPK抑制剂所产生的功能，其机制可能是摘要：①通过保护系膜细胞免遭氧化损伤而抑制MCP1的分泌；②通过抑制p38MAPK信号通路而抑制MCP1在系膜细胞的表达.表明亚硒酸钠可能通过抑制p38MAPK而延缓DN的发生发展，但亚硒酸钠是否通过抗氧化而抑制p38MAPK亦或功能于信号通路的其它环节尚需进一步深入探索，提示硒在防治DN发生发展过程中发挥着积极功能.

【参考文献

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［8］HaHJ,YuMR,JinCY,etal.Roleofhighglucoseinducednuclearfactor［kappa］Bavtivationinmonocytechemoattractantprotein1expressionbymesangialcells［J］.JAmSocNephrol,2002,13(4)摘要:894-902.

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单细胞生物总结范文1篇6

【关键词】青藤碱

摘要：【目的】研究青藤碱抗炎、抗风湿作用机理。【方法】采用小鼠巨噬细胞株J774体外培养，观察药物对该细胞株增殖、一氧化氮(NO)合成以及肿瘤坏死因子α信使核糖核酸(TNFαmRNA)表达及生物合成的影响。【结果】青藤碱能够抑制该细胞株增殖，抑制脂多糖(LPS)刺激状态下的NO合成；对TNFα蛋白合成具有抑制作用，但仅在高浓度时才对TNFαmRNA表达具有轻微的抑制作用。【结论】青藤碱可能通过下调单核／巨噬细胞系统炎症介质和细胞因子合成发挥抗炎、抗风湿作用。

关键词：关节炎，类风湿／中药疗法；青藤碱／药理学；细胞，培养的；一氧化氮；肿瘤坏死因子

青藤碱(sinomenine)是从中药青风藤中提取的一种单体生物碱，具有抗炎、抗风湿、免疫抑制、镇痛、镇静等多方面的药理作用［1］，临床用于治疗类风湿性关节炎(RA)等自身免疫性疾病疗效较好，且副作用小［2］。巨噬细胞在RA等自身免疫性疾病的发病中具有重要作用，有研究认为凡是对RA有效的治疗方法或药物均能下调单核／巨噬细胞系统的功能［3］。因此，我们选择了具有正常巨噬细胞显著特征的J774巨噬细胞株［4］，观察该药对其生长及炎症介质基因表达和生物合成的影响。

1材料与方法

11材料

111J774巨噬细胞株

引自第一军医大学自由基教研室，来源于AmericanTypeCultureCollection(ATCC，美国)。细胞采用含体积分数为10%的胎牛血清的RPMI1640培养液(含青霉素、链霉素各1000U・L－1)传代培养，选择对数生长期的传代培养细胞用于实验。

112主要试剂

青藤碱纯品(原料药)由湖南正清制药公司提供；消炎痛(indomethacin)纯品，美国Cayman公司；胎牛血清，杭州四季青产品；RPMI1640、DMEM培养基，美国GIBCO公司；一氧化氮(NO)检测试剂盒和小鼠肿瘤坏死因子α(TNFα)检测试剂盒，深圳晶美生物工程有限公司；总核糖核酸(RNA)提取试剂盒和逆转录聚合酶链反应(AccessRTPCR)试剂盒，Promega公司；脂多糖(LPS)和噻唑蓝(MTT)，Sigma公司；其他试剂为国产分析纯。

12方法

121青藤碱对J774细胞增殖的影响

采用MTT法检测，方法参照文献［5，6］。

122青藤碱对J774细胞株合成NO、TNFα的影响

细胞采用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液培养，调整细胞浓度为1×109／L，加500μL入24孔板，贴壁3h后，每孔加含不同浓度青藤碱的培养液500μL，LPS10μL(终浓度10mg/L)，继续培养24h，收集上清液，20℃保存。按NO试剂盒(酶法)说明进行检测，cNO(μmol/L)＝D测定管／D标准管×100μmol/L；按TNFα检测试剂盒(ELISA法)说明检测TNFα浓度值(ng／L）。

123细胞总RNA的提取

调整细胞浓度为1×109／L，每孔加2mL入6孔细胞培养板，贴壁2h后加LPS和不同浓度的青藤碱(LPS终浓度为10mg/L)，继续培养4h后提取细胞总RNA(操作按试剂盒说明进行)。

124TNFαmRNA表达的检测

采用RTPCR法［7］，引物由上海生物工程公司合成，TNFα的引物为：5AGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAA3(Sense)，5ACACCCATTCCCTTCACAGAGCAAT3（Antisense)(446bp)。以βactin作为内参。取8μLRTPCR扩增反应产物＋2μL溴酚蓝加样缓冲液，15g/L琼脂糖电泳1h，溴乙锭(EB)染色30min后，UVP凝胶摄相仪照相分析结果。

2结果

21青藤碱对J774细胞增殖的影响

青藤碱和消炎痛对J774细胞株细胞增殖均具有显著的抑制作用，其半数抑制药物浓度分别约为1mmol/L和0094mmol/L(图1)。从细胞增殖结果分析，其后的实验设计青藤碱的浓度均采用c≤1mmol/L(低于或等于达到半数抑制率的药物浓度)。

22青藤碱对J774细胞株一氧化氮(NO)合成的影响

青藤碱作用24h能够抑制LPS刺激状态下J774细胞合成NO，其半数抑制药物浓度约在500～1000μmol/L之间(图2)。

23青藤碱对J774细胞株TNFα蛋白合成的影响

在625μmol/L、500μmol/L、1mmol/L浓度下，青藤碱能够显著抑制LPS刺激状态下TNFα蛋白合成，抑制率分别为2901%、4946%、9364%(图3)。

24青藤碱对J774细胞株TNFαmRNA基因表达的影响

以LPS刺激J774细胞，培养2h，对TNFαmRNA表达的刺激作用轻微。青藤碱1mmol/L对不加或加LPS刺激状态下TNFαmRNA的表达具有轻微抑制作用，其抑制率分别为(125±65)%，(157±59)%（P＜005，n=3）；但在100μmol/L、10μmol/L浓度下，青藤碱对LPS刺激状态下TNFαmRNA基因表达无明显影响(图4)。

转贴于3讨论

NO自由基是一种在免疫调节、炎症介导中起重要作用的递质，在炎症反应中能够促使血管舒张、引起水肿、增加炎症性渗出、激活前列腺合酶等。RA病人血清和滑液中NO自由基水平均升高，提示NO作为一种炎症介质在RA发病中有重要作用。由于在RA炎症关节中巨噬细胞是NO合成的一个主要细胞群，青藤碱对巨噬细胞增殖及NO合成的影响可能对抑制RA病人滑膜炎症反应和过度炎症反应引起的氧化性损伤起到改善作用，这与文献的有关报道是一致的［8］。

由于滑膜内衬巨噬细胞样细胞在RA发病的早期和疾病的活动期能够无限地增殖，并且成为RA滑膜TNFα产生的主要细胞群；而TNFα可促进其他炎症性细胞因子、生长因子的合成，并可作用于成纤细胞和软骨细胞，在RA早期血管翳生成和后期骨破坏中起重要作用［9］。青藤碱对J774巨噬细胞增殖和TNFα合成的抑制作用说明，它可能对RA单核／巨噬细胞系统的亢奋状态具有一定的拮抗作用，而研究认为临床对RA有效的治疗均能下调单核／巨噬细胞系统功能［2］。故由此推测，青藤碱在临床上可能通过抑制滑膜内衬巨噬细胞样细胞恶性增殖及TNFα合成而对RA滑膜炎的发展进程具有一定程度的阻断作用，同时由于TNFα可促进NO的合成，故青藤碱抑制NO合成的作用可能部分通过抑制TNFα的合成而介导［10］。

另外，青藤碱对LPS刺激状态下TNFα蛋白合成有显著的抑制作用，但仅能轻微地抑制TNFαmRNA的表达，提示青藤碱作用的主要靶点可能在蛋白质合成水平，具体机制值得进一步深入研究。

参考文献

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单细胞生物总结范文篇7

【摘要】探讨急性胆管炎状态下细胞免疫中枢胸腺的变化以及中药锦红片的干预作用。方法:雄性清洁级SD大鼠24只，随机分为3组，每组8只。胆总管单纯结扎组（简称单纯结扎组）:结扎胆总管，但不注射细菌，手术后喂生理盐水;模型组:建立大鼠急性胆管炎模型，造模手术后喂生理盐水;锦红片治疗组:造模手术后喂锦红片悬液。手术后5d处死大鼠，胸腺取材，做胸腺电镜和光镜形态学观察，并检测胸腺质量、胸腺指数、凋亡指数、胸腺Bcl-2基因编码蛋白表达和胸腺Fas基因编码蛋白的表达。结果:形态学上凋亡细胞出现频率由高到低依次为模型组、锦红片治疗组和单纯结扎组。模型组胸腺质量和胸腺指数均降低，与锦红片治疗组和单纯结扎组相比，差异有统计学意义。模型组胸腺凋亡指数明显高于锦红片治疗组和单纯结扎组。锦红片治疗组Bcl-2基因编码蛋白表达高于模型组，Fas基因编码蛋白表达组间差异无统计学意义。结论:急性胆管炎时大鼠胸腺质量、胸腺指数降低，胸腺凋亡指数升高，非生理性凋亡增加。清热通下中药锦红片有一定的抑制这种非生理性凋亡的作用，这种作用可能是通过上调凋亡抑制基因Bcl-2编码蛋白的表达实现的。

【关键词】胸腺;胆管炎;清热;通下;锦红片

胸腺是机体的细胞免疫中枢，未成熟的T淋巴细胞通过在胸腺内的分化、发育，成熟后释放入血，以维持外周T淋巴细胞池的衡定［1］。凋亡是胸腺细胞维持外周T淋巴细胞质和量的主要方式，其过程受到严格调控［2］。以往鲜有急性胆管炎与胸腺细胞凋亡方面的报道，而我们在过去的实验中发现，治疗急性胆道感染方面疗效显著的清热通下中药锦红片对胆管炎动物外周免疫反应有调控作用［3～5］。为了解中药锦红片在治疗急性胆管炎中对细胞免疫中枢胸腺的影响，我们进行了以下实验研究。

1材料与方法

1.1实验材料清洁级SD大鼠，雄性，10周龄，体质量160～180g，由上海中医药大学实验动物中心提供。LIBRORAEL-160电子天平，日本岛津公司产品;AHBT-5B显微镜，Olympus公司产品;TEM-1200透射电镜，日本日立公司产品;石腊切片机，日本Aiwa公司产品;缺口末端标记法（Tdt-mediatedfluorescein-dUTPnickendlabeling，TUNEL）试剂盒，BoehringerMannheim公司产品;Bcl-2单克隆抗体（兔抗鼠IgG）和Fas单克隆抗体（兔抗鼠IgG），Gene公司产品;免疫组化试剂盒，福州迈新生物技术公司产品;蛋白酶K、DNA酶和二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB），Sigma公司产品。

1.2实验方法动物领来后放入实验场所3d以适应环境，造模前禁食8h，禁水4h。参照龚建平等［6］的造模方法，将实验大鼠胆总管结扎，同时向胆总管内注入致病性大肠杆菌，建立大鼠急性胆道感染模型。

1.3实验分组24只SD大鼠随机分为3组，每组8只。胆总管单纯结扎组（简称单纯结扎组）:结扎胆总管，但不注射细菌，手术后喂以生理盐水。模型组:造模手术后喂以生理盐水。锦红片治疗组:造模手术后喂锦红片悬液，由上海中药制药一厂提供锦红片干粉，以蒸馏水配成含干粉110mg/ml的悬混液，按10ml/kg体质量灌胃，2次/d。于手术后第5天处死大鼠，胸腺取材。

1.4检测指标

1.4.1胸腺质量和胸腺指数完整取出胸腺后，电子天平称取胸腺质量，计算胸腺指数。胸腺指数=胸腺质量（mg）/体质量（g）

1.4.2光镜观察胸腺组织以中尔马林固定，常规脱水，包埋，切片，脱腊至水，HE染色。

1.4.3电镜观察取约1mm×2mm的胸腺组织，用2.5%戊二醛固定，梯度脱水，包埋，超薄切片，醋酸铅染色，透射电镜下观察。

1.4.4Bcl-2基因编码蛋白免疫组化2μm石腊切片，脱腊至水，3%H2O2室温孵育5～10min，以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗，用微波热修复抗原，PBS浸泡5min，5%～10%正常山羊血清封闭，室温孵育10min;倾去血清，滴加1∶200Bcl-2单抗100μl，37℃孵育60min或4℃过夜;PBS冲洗3次，5min/次;滴加适当比例的生物素标记二抗100μl，37℃孵育10～30min;PBS冲洗3次，5min/次;滴加适当比例稀释的抗生物素辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，37℃孵育10～30min;PBS冲洗3次，5min/次，加DAB显色;自来水充分冲洗，复染，封片。同时设立阴性对照，以正常兔血清代替一抗。

1.4.5Fas基因编码蛋白免疫组化步骤基本同上，Fas单抗工作浓度为1∶150。

1.4.6TUNEL检测按原位细胞凋亡检测试剂盒说明操作，即以生物素化脱氧三磷酸尿苷（deoxy-uridinetriphosphate，dUTP）标记DN段钝端，再用免疫组化法放大标记信号，用DAB显色，苏木素衬染。

1.4.7切片分析对TUNEL检测、Bcl-2及Fas表达分析，在不告知动物分组信息的前提下，分别送复旦大学医学院和上海交通大学医学院作阅读分析并出具报告。

1.5统计学方法胸腺质量、胸腺指数、凋亡指数等用x±s表示，数据用SPSS10.0统计软件进行方差分析。免疫组化数据用χ2检验。

2结果

2.1各组胸腺质量和胸腺指数模型组胸腺质量和胸腺指数均降低，而锦红片治疗组均升高。见表1。

2.2TUNEL检测高倍镜下随机计算各组每份标本上、下、左、中、右5个视野的凋亡指数。凋亡指数（%）=（阳性细胞数/细胞总数）×100。经TUNEL标记后，光镜下凋亡细胞的核呈深棕色，标记阳性细胞着色多位于细胞核周边，核中央反应不明显，细胞结构仍较完好。见表2、图1。

表1各组胸腺质量和胸腺指数（略）

Table1Theweightandindexofthymusinthreegroups

*P<0.05，**P<0.01，vsuntreatedgroup.

表2各组胸腺凋亡指数（略）

Table2Theindexofapoptosisofthymusinthreegroups

*P<0.05，**P<0.01，vsuntreatedgroup.

2.3Bcl-2和Fas表达分析Bcl-2阳性细胞着色多位于胞浆及胞膜。锦红片治疗组胸腺Bcl-2基因编码蛋白表达与模型组相比，差异有统计学意义（P<0.01）。Fas阳性细胞着色多位于胞浆、胞膜，部分位于胞膜外。根据细胞有无着色、着色深浅及着色细胞的比例拟定半定量评分。A项按显色有无及显色深浅计分:0分为不着色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色;B项按显色细胞的比例评分:1分为1%～10%，2分为11%～30%，3分为31%～50%，4分为51%以上。每例总积分=A×B，总积分0分为（），1～3分为（+），3～6分为（++），6分以上为（+++）。各组Bcl-2和Fas表达均检测8份标本，每张切片高倍镜下随机取上、下、左、中、右5个视野计数。结果见表3。

2.4光镜观察模型组胸腺皮质变薄，有少量炎性细胞浸润，胸腺细胞密度降低，有少量点状坏死灶;锦红片治疗组胸腺皮质较模型组厚，同单纯结扎组基本相同，有少量炎性细胞浸润，胸腺细胞数较模型组多，未见明显坏死灶。

2.5电镜观察各组胸腺细胞结构基本相同，模型组胸腺中有较多巨噬细胞，可见大量典型的凋亡细胞，特征为染色质浓缩、边聚、核膜皱缩，微绒毛消失，凋亡小体形成，部分呈新月形，细胞膜完整，细胞器存在，可见凋亡小体被邻近细胞及巨噬细胞吞噬现象。与TUNEL检测到的胸腺凋亡指数结果相似，电镜观察到胸腺中的凋亡细胞比例以模型组最高，锦红片治疗组次之，单纯结扎组最低。见图2。

图1各组胸腺组织TUNEL阳性（×400）（略）

Figure1TUNELpositivethymusinthreegroups（×400）

A:Ligationgroup;B:Untreatedgroup;C:JinhongTablet-treatedgroup.

图2各组透射电镜下胸腺细胞超微结构（×5000）（略）

Figure2Thestructureofthymocyteinthreegroupsunderelectrontransmissionmicroscopy（×5000）

A:Ligationgroup;B:Untreatedgroup;C:JinhongTablet-treatedgroup

表3胸腺Bcl-2和Fas基因编码蛋白表达（略）

Table3ExpressionsofBcl-2andFasgenecodingproteins

3讨论

胸腺是T淋巴细胞成熟的场所，胸腺细胞成熟过程中，某些细胞克隆的清除、选择，都涉及到凋亡机制，识别自身抗原的自身反应T淋巴细胞在胸腺发育成熟后，甚至在发育过程中就经凋亡途径被清除。细胞数目的动态观察表明，胸腺是一个大量产生短命细胞的场所，大多数胸腺淋巴细胞未发育成熟即已凋亡［7，8］。脂多糖静脉注射能引起胸腺细胞凋亡，并且伴有血浆肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）含量升高，而抗TNF-α抗体可抑制引起的胸腺细胞DNA的片段化;IL-1、IL-2可分别抑制T细胞受体介导的未成熟胸腺细胞的凋亡和糖皮质激素介导的T淋巴细胞的凋亡［9～11］。细胞凋亡的基因调控机制是近年研究的热点，根据作用的不同，可将与细胞凋亡有关的基因分为凋亡促进基因（称自杀基因）和凋亡抑制基因（或称生存基因）。Bcl-2是公认的生存基因，Fas则属于自杀基因。凋亡活动是若干相关基因共同作用完成的，不可能是单一基因表达的结果［12，13］。通过凋亡过程死亡的胸腺皮质细胞绝大多数不能表达Bcl-2，Bcl-2表达参与T细胞的保留;Fas与胸腺细胞的发育有关，Fas系统与Bcl-2的相互作用决定了胸腺细胞的发育过程［14，15］。急性梗阻性胆管炎宿主胸腺细胞凋亡情况的变化鲜有报道。有资料显示TNF-α、内毒素体内外均可诱导胸腺细胞凋亡［16，17］。本研究同期进行的相关生化等实验结果表明，模型组血浆内毒素、TNF-α、IL-6、IL-8等增高，因此推测急性梗阻性胆管炎宿主胸腺细胞凋亡增多。本研究发现，与胆总管单纯结扎组比较，模型组胸腺质量明显降低，胸腺指数降低（P<0.01），胸腺皮质变薄，胸腺细胞密度降低，凋亡指数增高（P<0.05），并出现大量典型的凋亡小体，提示模型组胸腺细胞凋亡明显增加，虽然镜下观察到模型组胸腺有少量点状坏死灶，但这不应成为胸腺质量减轻的主要原因。结合同期其他的实验结果，推测外周血中CD3、CD4淋巴细胞减少是细胞免疫中枢胸腺细胞凋亡增多，导致效应细胞减少所致。锦红片治疗组胸腺质量及胸腺指数明显高于模型组，表明中药治疗后胸腺受损程度明显减轻，有保护胸腺的作用。并且锦红片治疗组胸腺凋亡指数明显低于模型组，可以认为，锦红片能抑制胸腺细胞的过度凋亡，以此维持机体细胞免疫功能的相对稳定。中药抑制胸腺细胞的凋亡可能与其诱导内毒素耐受有关。有报道称反复多次注射小剂量内毒素的动物其胸腺质量、胸腺指数及胸腺活细胞数均明显高于一次注射大剂量内毒素，而梯状DNA则减少，并且，随注射内毒素量的增加，对胸腺的保护作用越强［1］。同期的研究中锦红片治疗组血浆内毒素明显低于模型组，实际起到了诱导内毒素耐受、保护胸腺的作用。本研究锦红片治疗组Bcl-2基因编码蛋白表达多于模型组，而且细胞凋亡也较少，Fas基因编码蛋白表达组间无明显差异，推测具有清热通下作用的中药锦红片可能是通过促进Bcl-2基因编码蛋白的表达而在一定程度上抑制了细胞凋亡。

【参考文献】

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单细胞生物总结范文

知识是青年人的最佳的荣誉，老年人最大的慰藉，穷人最宝贵的财产，富人最珍贵的装饰品。下面小编给大家分享一些生物高中必修一知识，希望能够帮助大家，欢迎阅读!

生物高中必修一知识1第一节从生物圈到细胞

一、相关概念

细胞：是生物体结构和功能的基本单位。除了病毒以外,所有生物都是由细胞构成的。细胞是地球上最基本的生命系统。

生命系统的结构层次：细胞组织器官系统(植物没有系统)个体种群群落生态系统生物圈

二、病毒的相关知识

1、病毒(Virus)是一类没有细胞结构的生物体。

主要特征：

①个体微小，一般在10~30nm之间，大多数必须用电子显微镜才能看见;

②仅具有一种类型的核酸，DNA或RNA，没有含两种核酸的病毒;

③专营细胞内寄生生活;

④结构简单，一般由核酸(DNA或RNA)和蛋白质外壳所构成。

2、根据寄生的宿主不同，病毒可分为动物病毒、植物病毒和细菌病毒(即噬菌体)三大类。

根据病毒所含核酸种类的不同分为DNA病毒和RNA病毒。

3、常见的病毒有：人类流感病毒(引起流行性感冒)、SARS病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)[引起艾滋病(AIDS)]、禽流感病毒、乙肝病毒、人类天花病毒、狂犬病毒、烟草花叶病毒等。

第二节细胞的多样性和统一性

一、细胞种类：

根据细胞内有无以核膜为界限的细胞核，把细胞分为原核细胞和真核细胞。

二、原核细胞和真核细胞的比较：

1、原核细胞：细胞较小，无核膜、无核仁，没有成形的细胞核;遗传物质(一个环状DNA分子)集中的区域称为拟核;没有染色体，DNA不与蛋白质结合;细胞器只有核糖体;有细胞壁,成分与真核细胞不同.

2、真核细胞：细胞较大，有核膜、有核仁、有真正的细胞核;

有一定数目的染色体(DNA与蛋白质结合而成);一般有多种细胞器。

3、原核生物：由原核细胞构成的生物。

如：蓝藻、细菌(如硝化细菌、乳酸菌、大肠杆菌、肺炎双球菌)、放线菌、支原体等都属于原核生物。

4、真核生物：由真核细胞构成的生物。

如动物(草履虫、变形虫)、植物、真菌(酵母菌、霉菌、粘菌)等。

三、细胞学说的建立：

1、1665

英国人虎克(RobertHooke)用自己设计与制造的显微镜(放大倍数为40-140倍)观察了软木的薄片，第一次描述了植物细胞的构造，并首次用拉丁文cella(小室)这个词来对细胞命名。

2、1680

荷兰人列文虎克(A.vanLeeuwenhoek)，首次观察到活细胞，观察过原生动物、人类精子、鲑鱼的红细胞、牙垢中的细菌等。

3、19世纪30年代德国人施莱登(Matthias

JacobSchleiden)、施旺(TheodarSchwann)提出：一切植物、动物都是由细胞组成的。细胞是一切动植物的基本单位。这一学说即“细胞学说(CellTheory)”，它揭示了生物体结构的统一性.

生物高中必修一知识2第一节细胞中的元素和化合物

1、生物界与非生物界具有统一性：组成细胞的化学元素在非生物界都可以找到

2、生物界与非生物界存在差异性：组成生物体的化学元素在细胞内的含量与在非生物界中的含量明显不同

3、组成生物体的化学元素有20多种

4、在活细胞中含量最多的化合物是水(85%-90%);含量最多的有机物是蛋白质(7%-

10%);占细胞鲜重比例最大的化学元素是O、占细胞干重比例最大的化学元素是C.

第二节生命活动的主要承担者——蛋白质

一、相关概念：

1、氨基酸：蛋白质的基本组成单位，组成蛋白质的氨基酸约有20种。

2、脱水缩合：一个氨基酸分子的氨基(—NH2)与另一个氨基酸分子的羧基(—COOH)相连接，同时失去一分子水。

3、肽键：肽链中连接两个氨基酸分子的化学键(—NH—CO—).

4、二肽：由两个氨基酸分子缩合而成的化合物，只含有一个肽键。

5、多肽：由三个或三个以上的氨基酸分子缩合而成的链状结构。

6、肽链：多肽通常呈链状结构,叫肽链。

二、氨基酸分子通式：

NH2—(R—CH—COOH)

三、氨基酸结构的特点：

每种氨基酸分子至少含有一个氨基(—NH2)和一个羧基(—COOH)，并且都有一个氨基和一个羧基连接在同一个碳原子上(如：有—NH2和—COOH但不是连在同一个碳原子上不叫氨基酸);R基的不同导致氨基酸的种类不同。

四、蛋白质多样性的原因：

组成蛋白质的氨基酸数目、种类、排列顺序不同，多肽链空间结构千变万化。

五、蛋白质的主要功能(生命活动的主要承担者)：

1、构成细胞和生物体的重要物质，如肌动蛋白;

2、催化作用：如酶;

3、调节作用：如胰岛素、生长激素;

4、免疫作用：如抗体,抗原;

5、运输作用：如红细胞中的血红蛋白。

六、有关计算：

1、肽键数

=脱去水分子数=氨基酸数目-肽链数

2、至少含有的羧基(—COOH)或氨基数(—NH2)

=肽链数

第三节遗传信息的携带者——核酸

1、核酸的种类：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。

2、核酸：是细胞内携带遗传信息的物质，对于生物的遗传、变异和蛋白质的合成具有重要作用。

3、组成核酸的基本单位是：核苷酸，是由一分子磷酸、一分子五碳糖(DNA为脱氧核糖、RNA为核糖)和一分子含氮碱基组成;

组成DNA的核苷酸叫做脱氧核苷酸，组成RNA的核苷酸叫做核糖核苷酸。

4、DNA所含碱基有：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)

5、RNA所含碱基有：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)、尿

嘧啶(U)

6、核酸的分布：真核细胞的DNA主要分布在细胞核中;

线粒体、叶绿体内也含有少量的DNA;RNA主要分布在细胞质中。

第四节细胞中的糖类和脂质

一、相关概念：

1、糖类：是主要的能源物质;主要分为单糖、二糖和多糖等;

2、单糖：是不能再水解的糖.如葡萄糖;

3、二糖：是水解后能生成两分子单糖的糖;

4、多糖：是水解后能生成许多单糖的糖.多糖的基本组成单位都是葡萄糖;

5、可溶性还原性糖：葡萄糖、果糖、麦芽糖等。

生物高中必修一知识3第一节细胞膜——系统的边界

一、细胞膜的成分：主要是脂质(约50%)和蛋白质(约40%)还有少量糖类(约2%--10%)。

二、细胞膜的功能：

1、将细胞与外界环境分隔开

2、控制物质进出细胞

3、进行细胞间的信息交流

三、植物细胞还有细胞壁，主要成分是纤维素和果胶，对细胞有支持和保护作用;其性质是全透性的。

第二节细胞器——系统内的分工合作

一、相关概念：

1、细胞质：在细胞膜以内、细胞核以外的原生质，叫做细胞质。

细胞质主要包括细胞质基质和细胞器。

2、细胞质基质：细胞质内呈液态的部分是基质，是细胞进行新陈代谢的主要场所。

3、细胞器：细胞质中具有特定功能的各种亚细胞结构的总称。

二、八大细胞器的比较

1、线粒体：(呈粒状、棒状，具有双层膜，普遍存在于动、植物细胞中，内有少量DNA和RNA内膜突起形成嵴，内膜、基质和基粒中有许多种与有氧呼吸有关的酶)，线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，生命活动所需要的能量，大约95%来自线粒体，是细胞的“动力车间”。

2、叶绿体：(呈扁平的椭球形或球形，具有双层膜，主要存在绿色植物叶肉细胞里)，叶绿体是植物进行光合作用的细胞器，是植物细胞的“养料制造车间”和“能量转换站”，(含有叶绿素和类胡萝卜素，还有少量DNA和RNA，叶绿素分布在基粒片层的膜上，在片层结构的膜上和叶绿体内的基质中，含有光合作用需要的酶)。

3、核糖体：椭球形粒状小体，有些附着在内质网上，有些游离在细胞质基质中，是细胞内将氨基酸合成蛋白质的场所。

4、内质网：由膜结构连接而成的网状物，是细胞内蛋白质合成和加工，以及脂质合成的“车间”。

5、高尔基体：在植物细胞中与细胞壁的形成有关，在动物细胞中与蛋白质(分泌蛋白)的加工、分类运输有关。

6、中心体：每个中心体含两个中心粒，呈垂直排列，存在于动物细胞和低等植物细胞，与细胞的有丝分裂有关。

7、液泡：主要存在于成熟植物细胞中，液泡内有细胞液。

化学成分：有机酸、生物碱、糖类、蛋白质、无机盐、色素等。有维持细胞形态、储存养料、调节细胞渗透吸水的作用。

8、溶酶体：有“消化车间”之称，内含多种水解酶，能分解衰老、损伤的细胞器，吞噬并杀死侵入细胞的病毒或病菌。

三、分泌蛋白的合成和运输：

核糖体(合成肽链)内质网(加工成具有一定空间结构的蛋白质)高尔基体(进一步修饰加工)囊泡细胞膜细胞外

四、生物膜系统的组成：包括细胞器膜、细胞膜和核膜等。

第三节细胞核——系统的控制中心

一、细胞核的功能：

是遗传信息库(遗传物质储存和复制的场所)，是细胞代谢和遗传的控制中心;

二、细胞核的结构：

1、染色质：由DNA和蛋白质组成，染色质和染色体是同样物质在细胞不同时期的两种存在状态。

2、核膜：双层膜，把核内物质与细胞质分开。

3、核仁：与某种RNA的合成以及核糖体的形成有关。

4、核孔：实现细胞核与细胞质之间的物质交换和信息交流。

生物高中必修一知识4第一节物质跨膜运输的实例

一、渗透作用：水分子(溶剂分子)通过半透膜的扩散作用。

二、原生质层：细胞膜和液泡膜以及两层膜之间的细胞质。

三、发生渗透作用的条件：

1、具有半透膜

2、膜两侧有浓度差

四、细胞的吸水和失水：

外界溶液浓度>细胞内溶液浓度细胞失水

外界溶液浓度

第二节生物膜的流动镶嵌模型

一、细胞膜结构：磷脂蛋白质糖类

二、结构特点：具有一定的流动性;功能特点：选择透过性

第三节物质跨膜运输的方式

一、相关概念：

1、自由扩散：物质通过简单的扩散作用进出细胞。

2、协助扩散：进出细胞的物质要借助载体蛋白的扩散。

3、主动运输：物质从低浓度一侧运输到高浓度一侧，需要载体蛋白的协助，同时还需要消耗细胞内化学反应所释放的能量。

二、自由扩散、协助扩散和主动运输的比较

三、离子和小分子物质主要以被动运输(自由扩散、协助扩散)和主动运输的方式进出细胞;大分子和颗粒物质进出细胞的主要方式是胞吞作用和胞吐作用。

生物高中必修一知识5第一节降低化学反应活化能的酶

一、相关概念：

1、新陈代谢：是活细胞中全部化学反应的总称，是生物与非生物最根本的区别，是生物体进行一切生命活动的基础。

2、细胞代谢：细胞中每时每刻都进行着的许多化学反应。

3、酶：是活细胞(来源)所产生的具有催化作用(功能：降低化学反应活化能，提高化学反应速率)的一类有机物。

4、活化能：分子从常态转变为容易发生化学反应的活跃状态所需要的能量。

二、酶的发现：

1、1783年，意大利科学家斯巴兰让尼用实验证明：胃具有化学性消化的作用;

2、1836年，德国科学家施旺从胃液中提取了胃蛋白酶;

3、1926年，美国科学家萨姆纳通过化学实验证明脲酶是一种蛋白质;

4、20世纪80年代，美国科学家切赫和奥特曼发现少数RNA也具有生物催化作用。

三、酶的本质：

大多数酶的化学本质是蛋白质(合成酶的场所主要是核糖体,水解酶的酶是蛋白酶)，也有少数是RNA。

四、酶的特性：

1、高效性：催化效率比无机催化剂高许多;

2、专一性：每种酶只能催化一种或一类化合物的化学反应;

3、酶需要较温和的作用条件：在最适宜的温度和pH下，酶的活性最高。

温度和pH偏高和偏低，酶的活性都会明显降低。

第二节细胞的能量“通货”——ATP

一、ATP的结构简式：

ATP是三磷酸腺苷的英文缩写，结构简式：A-P～P～P，其中：A代表腺苷，P代表磷酸基团，～代表高能磷酸键，-代表普通化学键。

注意：ATP的分子中的高能磷酸键中储存着大量的能量，所以ATP被称为高能化合物。这种高能化合物化学性质不稳定，在水解时，由于高能磷酸键的断裂，释放出大量的能量。

二、ATP与ADP的转化

第三节ATP的主要来源——细胞呼吸

一、相关概念：

1、呼吸作用(也叫细胞呼吸)：指有机物在细胞内经过一系列的氧化分解，最终生成二氧化碳或其它产物，释放出能量并生成ATP的过程。

根据是否有氧参与，分为：有氧呼吸和无氧呼吸。

2、有氧呼吸：指细胞在有氧的参与下，通过多种酶的催化作用下，把葡萄糖等有机物彻底氧化分解，产生二氧化碳和水，释放出大量能量，生成ATP的过程。

3、无氧呼吸：一般是指细胞在无氧的条件下，通过酶的催化作用，把葡萄糖等有机物分解为不彻底的氧化产物(酒精、CO2或乳酸)，同时释放出少量能量的过程。

4、发酵：微生物(如：酵母菌、乳酸菌)的无氧呼吸。

二、有氧呼吸的总反应式：

C6H12O6+6O2——>6CO2+6H2O+能量

三、无氧呼吸的总反应式：

C6H12O6——>2C2H5OH(酒精)+2CO2+少量能量

或

C6H12O6——>2C3H6O3(乳酸)+少量能量

四、有氧呼吸过程(主要在线粒体中进行)

五、有氧呼吸与无氧呼吸的比较

六、影响呼吸速率的外界因素：

1、温度：温度通过影响细胞内与呼吸作用有关的酶的活性来影响细胞的呼吸作用。

温度过低或过高都会影响细胞正常的呼吸作用。在一定温度范围内，温度越低，细胞呼吸越弱;温度越高，细胞呼吸越强。

2、氧气：氧气充足，则无氧呼吸将受抑制;

氧气不足，则有氧呼吸将会减弱或受抑制。

3、水分：一般来说，细胞水分充足，呼吸作用将增强.但陆生植物根部如长时间受水浸没，根部缺氧，进行无氧呼吸，产生过多酒精，可使根部细胞坏死。

4、CO2：环境CO2浓度提高，将抑制细胞呼吸，可用此原理来贮藏水果和蔬菜。

七、呼吸作用在生产上的应用：

1、作物栽培时，要有适当措施保证根的正常呼吸，如疏松土壤等。

单细胞生物总结范文篇9

关键词：有丝分裂；高中生物；模型

中图分类号：G632文献标识码：B文章编号：1672-1578（2017）04-0138-01

掌握细胞的有丝分裂是今后学习减数分裂与遗传规律的基础，因此这部分内容是教学的重中之重。教师在教学过程中应当以学生为主体，基于学生的认知规律实施教学，引导学生全面理解与掌握这部分内容，完成新知识的内化。

1.调整坡度，循序渐进

从易到难、从简单到复杂的实施教学，有助于促进学生打好基础，强化理解，提高学习效率。因此，教师在教学时应当根据学生们的认知能力，适当对课本中的内容进行调整与编排，调整教学的难度，循序渐进的引导同学们掌握重点与难点。

比如在教学中，为了引导同学们发现并总结出细胞有丝分裂的各分裂时期的特点及变化，首先我播放了各分裂时期的动画，然后让同学们思考并讨论各分类时期图像的变化特征。我发现同学们在讨论时，首先关注的是细胞核内相关结构的变化，例如在细胞分裂中期，纺锤丝牵引着染色体运动，使每条染色体的着丝点排列在细胞中央的一个平面上，染色体形态稳定，数目清晰；在细胞分裂末期，纺锤丝消失，出现新的核膜、核仁，染色体变成染色质丝等等，但是同学们却忽略了总结细胞内染色体、DNA、染色单体的数量变化。由于在细胞分裂后期，同学们都明显的发现姐妹染色单体分开，成为两条子染色体，于是我提示道："细胞分裂后期，染色单体分开成为了染色体，那么与细胞分裂中期相比，染色单体染色体和DNA的数量有何变化呢？"通过观察，同学们很快发现：在中期，染色单体数量为4N，染色体数量为2N，DNA数量为4N；在后期，染色体数量变为4N，而染色单体数量为0，DNA数量为4N。紧接着我提出问题："同学们能否总结出细胞分裂各时期染色单体、染色体和DNA的数量变化呢？"引导同学们对这一问题进行归纳总结。

在上述教学活动中，我通过调整坡度，引导同学们一步一步总结出细胞有丝分裂各时期的图像特征及变化，强化了同学们的理解与记忆，高效达成了教学目标。

2.结合动画，生动对比

细胞有丝分裂的过程是一种微观、缓慢的动态变化，结合动画教学有助于帮助同学们观察到这一动态的过程，加深理解。需要注意的是，教师应当引导同学们对动画中细胞分裂的各个时期进行对比，从而使教学更加生动形象。

比如在教W过程中，针对纺锤体的变化，我引导同学们对细胞有丝分裂间期、前期、中期、后期和末期的动画进行对比。通过观察与对比，同学们可以明显的发现：在分裂间期，细胞内没有纺锤体存在；在分裂前期，细胞的两极发出纺锤丝，形成一个梭形的纺锤体；在分裂中期纺锤丝牵引着染色体运动；在分裂后期纺锤丝牵引子染色体向细胞两极移动；在分裂末期，纺锤体消失。此外，我还引导同学们通过对比总结出了细胞分裂各时期核膜、核仁、染色体、细胞核体积等形态、位置的变化。

在上述教学活动中，我通过合理利用动画，使微观的动态变化变得可视化，引导同学们生动、清晰的理解了有丝分裂细胞内物质、结构的动态变化，切身体会到了生命的动态之美，起到了很好的教学效果。

3.多元观察，建构模型

细胞有丝分裂过程中的核心变量是染色体的相关变化，判断细胞有丝分裂某一时期的染色体数量或者染色单体数量、DNA数量是高考中的常见题型，教师在教学时，可以引导同学们通过多元观察，建构相关变量的生物模型，从而加深理解与记忆。

比如我在教学过程中，引导同学们构建了关于细胞有丝分裂各时期染色体、DNA、染色单体数量的模型。首先我引导同学们总结出细胞有丝分裂各时期的变化规律。

4.妙设比喻，发展思维

"比喻教学法"是一种非常有效的教学方法，能够调动同学们的学习兴趣，将难以理解的知识变得浅显易懂。教师在教学过程中可以通过妙设比喻，发展同学们的思维，提高教学效果。

比如在讲解有丝分裂的相关知识时，同学们普遍觉得染色体、DNA、染色单体之间的关系难以理解。于是我将染色体比喻为包裹着铜丝的漆包线，将里面的铜丝和和外面的塑料皮比作为DNA和蛋白质，由此同学们可以发现，在正常状态下，细胞内的染色体与DNA数量比为1：1。而姐妹染色单体就相当于是将两根大小、形状相同的漆包线在某位点用胶带捆绑起来，胶带的附着点即为着丝点，这两根漆包线分离即为两条姐妹染色单体分开成为了两条独立的染色体。通过这样的比喻，同学们清楚了理解了三者间的数量关系，在没有染色单体的细胞中，染色体数=DNA数，在有染色单体的细胞中，DNA数=染色单体数=1/2染色体数。

在上述教学活动中，我通过运用适当的比喻，加深了同学们对知识的理解，促进同学们产生了深刻的记忆，使教学变得生动形象，提高了课堂教学的质量。

综上所述，教师在教学过程中通过调整坡度、结合动画、多元观察、妙设比喻等策略，能够高效引导学生从宏观到微观、从形态变化到数量变化整体掌握细胞有丝分裂的过程，提高课堂教学的效果，高效教学"有丝分裂"。

参考文献：

单细胞生物总结范文篇10

想知道我们聊了什么吗？请继续往下看。看完之后，你拿着化验单的手，再也不会颤抖。

血象

血象指的是血常规检查的结果，是对外周血中血细胞数量和质量的理化检查。血细胞包括白细胞、红细胞以及血小板;细胞质量主要指形态结构以及相关物质，比如红细胞体积、沉降速度以及其内含的血红蛋白（血红素）含量等。

因此，血象就是与血细胞相关的一系列参数，它为医生们诊疗病情提供参考。而我们通常说的血象高则专指血液中的白细胞偏高。

白细胞大家族

血液中的细胞都来自于骨髓中的造血干细胞。其中的白细胞是个大家族，是一类细胞的总称，若干年前也叫做白血球，因为它在血液中一般呈球形。不过千万别认为白细胞是白色的，它实际上是无色的。白细胞分为粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，前者又分为嗜酸性、嗜碱性和中性粒细胞，化验单上有它们的名字。

白细胞主要功能是参与机体的防御，它们大多“身体”柔软，能通过变形运动穿出血管进入各种机体组织。由于长期深入基层组织四处巡逻，很是辛苦，加之各地条件不同，比如在心脏和大肠白细胞用餐环境就相差甚远，所以白细胞寿命一般较短，几天到几十天不等。如若在巡逻中遭遇外来病原微生物入侵，它们便与之殊死搏斗，最终同归于尽，化做脓液，真可谓鞠躬尽瘁死而后已。

认识指标

血常规检查主要包括白细胞计数（WBC）、白细胞分类计数（DC）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（Hb）、血小板计数（PLT）以及红细胞沉降率（ESR）等。我们只需要掌握白细胞计数和白细胞分类计数中的淋巴细胞和中性粒细胞的相关参数即可。

1.白细胞计数

白细胞虽然是免疫细胞，也并非多多益善。白细胞的总数一般都是以109为计量单位。一般不超过10×109，婴幼儿稍高。

是不是有看不下去的感觉，不必太纠结，化验单上都有参考数据，你只需要认识和即可。如果化验单上用表示，就意味着白细胞偏高，也就是就是我们所说的血象偏高。如果过高，多见于各种细菌感染、慢性白血病以及一些化学药品的急性中毒。如果用表示，意味着白细胞减少，多见于病毒感染引起的疾病如流感、麻疹、风疹和肝炎等。白细胞高于或者低于正常值都是异常现象，如果要进一步确诊，一般都需要结合白细胞分类计数和白细胞形态等指标综合判断。

2.白细胞分类计数

（1）中性粒细胞

白细胞分类计数中最重要的莫过于中性粒细胞，占白细胞总数的50%～70%，它在急性感染中起重要作用。它的增多常见于急性、化脓性感染，包括扁桃体发炎、阑尾炎、中耳炎等局部感染和肺炎、猩红热等全身性感染。它的减少多见于病毒感染。

一句话：中性粒细胞变化原因类似于白细胞，增多多是细菌感染，减少多为病毒引起。

（2）淋巴细胞

淋巴细胞在免疫中也发挥着重要作用，它占到白细胞总数的20%～40%，我们常说的抗体便是其中一种淋巴细胞受到刺激后产生的。淋巴细胞增多多见于传染病和血液病，如水痘、麻疹、风疹、流行性腮腺炎、传染性肝炎、白血病等。而其减少原因则更多，但发生各种中性粒细胞增多症时，淋巴细胞则相对减少。

3.C反应蛋白（CRP）

C反应蛋白是在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质，由肝脏合成。它的升高与感染的程度正相关，在绝大多数病毒感染者的血清中，CRP浓度变化不大或基本保持不变，而细菌感染则急剧上升。

单细胞生物总结范文篇11

【摘要】目的:研究SPTATApoptin融合基因诱导人肝癌HepG2细胞凋亡和细胞周期阻滞，探讨其用于肝癌治疗的可能性。方法:通过DNA重组技术，以pcDNA3.1/Apoptin质粒11为模板，构建SPTATApoptin融合基因plenti6V5DTOPO真核表达载体。用SPTATApoptinplenti6V5DTOPO真核表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），转染后Blasticidin霉素进行筛选，并进行鉴定得到稳定表达SPTATApoptin的CHO细胞株。收集含有TATApoptin融合蛋白的筛选细胞培养上清，用于HepG2细胞培养。于共培养后的不同时段收集HepG2细胞，流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡和细胞周期。结果:用包含SPTATApoptin融合基因的plenti6V5DTOPO真核表达载体瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），成功筛选出稳定表达SPTATApoptin融合蛋白的CHO细胞，收集细胞培养上清，继续用于HepG2细胞培养，可观察到HepG2细胞阻滞于G1期并引起细胞凋亡。结论:SPTATApoptin融合表达可引起HepG2细胞的细胞周期G1期阻滞。

【关键词】信号肽;蛋白转导域;鸡贫血病毒;Apoptin蛋白;肝癌

二十世纪九十年代早期，人们发现由鸡贫血病毒(Chickenanemiavirus，CAV)来源的一种小蛋白VP3（Apoptin）能够诱导人转化细胞和肿瘤细胞凋亡，但对正常的人二倍体细胞无凋亡诱导作用［1］。Apoptin的肿瘤细胞特异性可能与其在细胞中的亚细胞定位有关，在转化或肿瘤细胞中Apoptin定位于细胞核，而在正常细胞中定位于细胞质。Apoptin诱导的细胞凋亡不依赖p53，且不为Bcl2、BclxL的过表达所抑制。Apoptin此种特性向我们展示了其在肿瘤治疗领域诱人前景［2］。但是使用传统的转染方法转染并表达活性肽，因受到转导效率和表达细胞的自杀死亡的限制，难达到有效治疗实体瘤的目的。HIVTAT是近年来发现的一种新型的高效运输载体蛋白质转导结构（proteintransductIondomains，PTDs）或称细胞穿膜肽（cellpenetratingpeptides，CPP）。HIVTAT能穿透细胞膜、细胞核膜，携带肽、蛋白质和DNA分子等进入胞质和胞核发挥生物效应，具有高效性、无须耗能或通过受体转运的特点，为提高靶细胞在体内外的基因转移效率和蛋白质表达提供了一个高效、简便的方法［3］。目前的体内及体外试验显示HIVTAT可以穿过包括神经元细胞在内的所有组织细胞，且未观察到明显毒副作用［4］。我们构建了带有分泌信号肽、蛋白转导结构域的融合基因SPTATApoptin从而实现转染细胞转染后的分泌表达TATApoptin融合蛋白的表达方式，可使融合蛋白进入未转染的肿瘤细胞。希望通过以上设计来实现对肝癌等实体瘤安全有效的特异性治疗。1材料和方法

1.1材料大肠杆菌DH5α、TOPO10B菌种为西北大学生命科学院分子微生物实验室保存;质粒pLenti6/V5DirectionalTOPO和大肠杆菌ShotStbl3TM购买于美国Invitrogen公司;质粒pcDNA3.1(+)/Apoptin［5］为中国军事医学科学院放射医学学研究所孙志贤研究员惠赠。HepG2肝癌细胞系、CHO(中国仓鼠卵巢细胞)购买于中国科学院上海细胞库。细胞培养于含有10mL/L胎牛血清的DMEM高糖培养基中。LipofectamineTM2000脂质体和AntiV5FITC单克隆抗体（mAb）购买于美国Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1SPTATApoptin融合基因真核表达载体的构建登陆GenBank拷贝鸡贫血病毒，CAV（NC_001427）序列。应用Invitrogen公司生物软件（VectorNTIAdvance9），选取Apoptin基因序列（bp486～852）;根据文献选取分泌信号肽（signalpeptide，SP）序列［6］和TAT的氨基酸序列和核苷酸序列［7］。根据以上序列设计PCR引物:primer1:5′GTGTGGGCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAATGAACGCTCTG

CAGGAAGATACTCC3′;primer2:5′CTGCAGTCTTATACGCCTTTTTGCGG3′;primer3:5′CACCATGTGGTGGCGCCTGTGGTGGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG3′。以pCDNA3.1/VP3为模版加入引物1和引物2，pfuDNA合成酶PCR扩增得平末端的含部分信号肽基因序列和TATVP3融合基因(命名为产物1);以产物1为模版及引物2和引物3，pfuDNA聚链酶PCR扩增得平末端的SPTATVP3重链基因(命名为产物2)。合成的SPTATApoptin融合基因DNA重组双链定向插入plenti6V5DTOPO载体，转化感受态细胞后扩增提取质粒进行酶切和测序鉴定，具体试验步骤见文献［8］。

1.2.2稳定表达SPTATApoptin融合基因的CHO细胞的筛选在6孔板内按1×105细胞/孔接种CHO细胞，筛选从转染后48h开始，CHO细胞均以8mg/LBlasticidin霉素的选择培养基继续培养，约20d至1月时出现多个Blasticidin霉素抗性的单克隆，用消毒后的枪头挑取单克隆细胞入24孔板，扩大培养，获得稳定表达SPTATApoptin融合基因的单克隆细胞，作为稳定转染细胞鉴定用。

1.2.3RTPCR对稳定表达SPTATApoptin融合基因的CHO细胞的鉴定分别离心收集筛选出稳定表达SPTATApoptin融合基因的单克隆CHO细胞或未转染的CHO细胞，采用TRIzolRNA分离试剂提取生长状态良好的细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度。取5μg总RNA，加入1μL的0.5g/Loligo(dT)，按照SuperScriptRT逆转录试剂盒产品说明书操作合成cDNA第一链。将反转录的cDNA-20℃冻存，以备进行PCR反应。使用引物2和引物3检测融合基因的表达，使用内参引物（GS5′caacggatttggtcgtattggg3′;GAS5′cctggaagatggtgatgggatt3′，210bp）进行小鼠GADPH的PCR扩增。PCR条件为:94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共进行30个循环。10g/L琼脂糖凝胶电泳，照相。

1.2.4Westernblot对稳定表达SPTATApoptin融合基因的CHO细胞的鉴定分别离心收集筛选出稳定表达SPTATApoptin融合基因的单克隆CHO细胞或未转染的CHO细胞，用冰上预冷的PBS洗3遍，用细胞裂解处理细胞收集蛋白，加入适量蛋白上样缓冲液，沸水煮5min，12000r/min离心10min，取20μL蛋白样品进行SDSPAGE凝胶电泳并将电泳结果进行PVDF转膜，用一抗即AntiV5FITCmAb(Invitrogen公司，货号:554243)，用PBST按1∶1000稀释，膜置于一抗稀释液中室温缓慢摇动1h。将辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体用PBST按1∶200稀释，膜在二抗中室温缓慢摇1h。进行Westernblot分析，具体操作步骤见试剂盒的说明书。

1.2.5共培养收集1×106生长状态良好的HepG2细胞接种于6孔板中，培养24h待细胞贴壁后用PBS洗2遍，加入2mL稳定表达SPTATApoptin融合基因的CHO细胞培养上清继续培养，并于共培养后的不同时间收集HepG2细胞进行后续检测。

1.2.6FCM分析共培养后的HepG2细胞周期分析于共培养后的24h、48h、72h和96h收集每孔中的HepG2细胞，PBS洗2遍，800～1000r/min离心5min，弃上清，加入1mL生理盐水制成单细胞悬液。加入预冷的无水乙醇2mL快速混匀，固定细胞。弃固定液，PBS洗2遍，1000r/min离心5min，加入1mLDNA荧光染料PI，4℃避光染色15min，FCM分析。

2结果

2.1SPTATApoptin融合基因真核表达载体的鉴定设计并合成的SPTATApoptin融合基因DNA双链定向插入plenti6V5DTOPO载体，转化感受态细胞后扩增提取质粒，经限制性内切酶EcoRI和SalI对提取的质粒做双酶切鉴定和测序，载体构建作用。

2.2Blasticidin霉素筛选浓度确定和筛选稳定表达SPTATApoptin融合基因的单克隆细胞为了获得SPTATApoptin融合基因表达的单克隆细胞株，本研究需筛选针对CHO细胞的Blasticidin霉素筛选浓度:经不同浓度的Blasticidin霉素筛选后，CHO细胞在含100mL/LFBS、8mg/LBlasticidin霉素的DMEM培养液中，到第8天能杀死所有细胞。因此，选8mg/LBlasticidin霉素分别为转染后CHO细胞的筛选浓度。提取筛选出的细胞总RNA，RTPCR扩增，表明筛选细胞可有效的转录SPTATApoptin融合基因的mRNA。对筛选的CHO细胞裂解液所进行的Westernblot检测结果显示表明筛选细胞可有效的表达SPTATApoptin融合蛋白（图1）。

2.3共培养后的HepG2细胞可观察到细胞周期G1期阻滞共培养后24、48、72、96h分别进行细胞周期检测发现，转染SPTATApoptin融合基因表达载体至CHO细胞后的培养上清与HepG2细胞共培养，可有效引起细胞凋亡、细胞周期阻滞于G0/G1期(图2）。

3讨论

Apoptin以其对肿瘤细胞的选择性诱导、毒性低等特点，已经受到了广泛的关注，成为新型的抗肿瘤候选药物之一。一系列的研究均显示了以Apoptin蛋白为基础的肿瘤特异性治疗的诱人前景［9］。通过将Apoptin基因与其他对肿瘤有治疗作用的基因相连接，构建融合基因，而获得对肿瘤有更显著作用的融合蛋白，也是Apoptin应用研究的一大热点。Guelen等［10］构建了一种新的融合蛋白TATApoptin，这是一种将TAT跨膜功能域与Apoptin相连接的融合蛋白。将该融合蛋白与细胞共培养30min后，其细胞内化高达98%;24h后，TATApoptin融合蛋白能诱导大部分的肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无杀伤活性性。

使用传统的转染方法转染并表达活性肽，因受到转导效率和表达细胞的自杀死亡的限制，难达到有效治疗实体瘤的目的。采用基因工程，将编码目的蛋白的基因序列融合到编码信号肽的DNA中可实现外源蛋白的分泌表达，可以防止宿主细胞对表达产物的降解，还可以使目的蛋白分泌出胞，杀伤比邻的未转染的肿瘤细胞，扩大治疗效应。我们构建了带有分泌信号肽，蛋白转导结构域的融合基因SPTATApoptin从而实现转染细胞转染后的分泌表达TATApoptin和TATGFP融合蛋白的表达方式，可使融合蛋白可以进入未转染的肿瘤细胞。我们在前期的实验中证明，SPTATApoptin融合基因转染后可有效的诱导HepG2细胞的凋亡［8］。

在本实验中，我们用连有SPTATApoptin融合基因的plenti6V5DTOPO真核表达载体转染CHO细胞，并用8mg/LBlasticidin霉素对转染后的CHO细胞进行筛选。其后，用RTPCR和Westernblot对筛选后的CHO细胞从转录和翻译水平进行鉴定，证明筛选的CHO细胞可有效的表达SPTATApoptin融合蛋白。收集筛选的CHO细胞的培养上清，继续用于接种于12孔板的HepG2细胞培养。并于共培养后的不同时间进行细胞周期的检测。共培养后24、48、72、96h分别进行细胞周期检测发现，转染SPTATApoptin融合基因表达载体至CHO细胞后的培养上清与HepG2细胞共培养，可有效引起细胞凋亡，细胞周期阻滞于G0/G1期。与何等［11］报道的Apoptin可引起肿瘤细胞G2/M期阻滞有一定的差异。这可能与实验方法的不同有关，因为何等在实验中采用腺病毒方式进行转染，而腺病毒可引起细胞G2/M期阻滞。至于TATApoptin将细胞周期阻滞于哪一期，其具体机制如何还有待于实验的进一步验证。

总之，SPTATApoptin融合表达可引起HepG2细胞的细胞周期G1期阻滞，并引起细胞凋亡，有望发展成为肝癌的等实体瘤的基因治疗策略。

参考文献

［1］NotebornMH.Chickenanemiavirusinducedapoptosis:underlyingmolecularmechanisms［J］.VetMicrobiol，2004，98(2):89-94.

［2］LeliveldSR，ZhangYH，RohnJL，etal.Apoptininducestumorspecificapoptosisasaglobularmultimer［J］.JBiolChem，2003，278(11):9042-9051.

［3］RothbardJB，JessopTC，LewisBS，etal.Roleofmembranepotentialandhydrogenbindinginthemechanismoftranslocationofguanidiniumrichpeptidesintocells［J］.JAmChemSoc，2004，126(31):9506-9507.

［4］RichardJP，MelikovK，BrooksH，etal.CellularuptakeofunconjugatedTATpeptideinvolvesclathrin2dependentendocytosisandheparansulphatereceptors［J］.JBiolChem，2005，280(15):15300-15306.

［5］孙国敬，童新，孙志贤.凋亡素的克隆及诱导HeLa细胞凋亡［J］.军事医学科学院院刊，2001，25(2):85-90.

［6］BarashS，WangW，ShiY.HumansecretorysignalpeptidedescriptionbyhiddenMarkovmodelandgenerationofastrongartificialsignalpeptideforsecretedproteinexpression［J］.BiochemBiophysResCommun，2002，294(4):835-842.

［7］HakanssonS，JacobsA，CaffreyM.HeparinbindingbytheHIV1tatproteintransductiondomain［J］.ProteinSci，2001，10(10):2138-2139.

［8］HanSX，MaJL，YiLv，etal.SecretoryTransactivatingTranscriptionapoptinfusionproteininducesapoptosisinhepatocellularcarcinomaHepG2cells［J］.WorldJGastroenterol，2008，14(23):3642-3649.

［9］KooistraK，ZhangYH，NotebornMH.Viralelementssensetumorigenicprocesses:approachingselectivecancertherapy［J］.MiniRevMedChem，2007，7(11):1155-1165.

单细胞生物总结范文篇12

关键词：人可溶性肿瘤病坏死因子受体1；克隆；真核表达；稳定转染

中图分类号：R575.3

文献标识码：A

文章编号：1007－7847(2007)01－0078－06

肿瘤坏死因子α(TumorNecrosisFactor，TNFα)是体内重要的免疫调节因子和炎症介质，它的生物学作用通过受体介导，TNFα过量表达与败血症休克、暴发性肝炎、类风湿性关节炎和移植后的排斥反应等疾病的发生有密切相关，而TNFα的可溶性受体(sTNFR1)可中和TNFα的毒性作用，因此sTNFR1有潜在的临床应用价值，本文拟构建sTNFR1的真核表达载体，并在NIH3T3中表达，为下一步sTNFR1用于基因治疗奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种、细胞株与质粒

JM109由我室保存，人Hela细胞株和小鼠成纤维细胞(NIH3T3)由中南大学肿瘤研究所提供，pGEM-T载体购自Promega公司，真核表达质粒pcDNA3.1(-)购自美国Invitrogen公司．

1.1.2酶及主要试剂

TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、BamHI、EcoRI、DNA回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自TakaRa公司，MMLV逆转录酶购自Promega公司，脂质体转染剂Lipofactamine2000购自美国Invitrogen公司，TRIzolReagentRNA分离液、DMEM(高糖)、新生牛血清和G418购自美国GIBCOBRL公司，兔抗人sTNFR1多克隆抗体购自PEPROTECH公司，Western-blotting检测试剂盒购自博士德公司，ECL试剂盒购自Amersham公司，常用试剂为国产或进口分析纯。

1.1.3引物

GAPDH引物：购自北京鼎国生物公司，上游引物序列：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′;下游引物序列：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′，目的片段452bp，人sTNFR1扩增用PCR引物参照其cDNA[7]设计，由上海博亚公司合成，上游引物：5′-GAATCCATGGATAGTGTGTGTCCCC-3′;下游引物：5′-GTCGACGGATCCTCAAATGATCAGGGGCAAC-3′，

1.1.4仪器

核苷酸测序使用AB1377全自动测序仪及配套的BigDyeTerminator试剂盒，由博亚公司完成，TannonGis凝胶分析系统为上海天能公司产品，

1.2方法

1.2.1RT-PCR扩增sTNFR1目的片段

自Hela细胞中提取总RNA作为逆转录模板，采用RT-PCR方法扩增sTNFR1基因，逆转录反应条件参照MMLV逆转酶说明书进行：取总RNA3μg，Oligo(18)0.5μg，Oligo(18)0.5μg，加DEPC水至总体积12μL，70℃5min后，立即置于冰上；然后加入5×RTBuffer5μL，dNTP12.5nmol，RNA酶抑制剂25U，MMLV逆转录酶200U。加DEPC水至总体积25L，42cI=60min逆转录，逆转录后产物为cDNA，PCR反应体系为cDNA2μL，TaqDNA聚合酶0.5U，10×Buffer(Mg2+)5μL，10mmol/LdNTP34μL，人sTNFRl引物各25pmol，加双蒸水至总体积50μL.PCR条件：95℃5min预变性，94℃40s变性，55℃40s退火，72℃1min延伸，32个循环后，72℃延伸15min．

1.2.2构建T载体克隆

PCR产物用DNA回收纯化试剂盒回收纯化后与T载体连接，转入感受态大肠杆菌JMl09，经蓝、白筛选，挑选单个阳性克隆，在含有100mg/L氨苄青霉素培养基中过夜生长，提取质粒，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定。

1.2.3构建真核表达载体亚克隆

将T载体克隆酶切后目的片段，质粒pcDNA3．1(－)用BamHI、EcoRI双酶切后经大齿孔电泳，DNA回收纯化试剂盒回收纯化，将纯化后的两基因片段16℃过夜连接，转入感受态细菌JMl09，挑取阳性克隆，接种于含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养过夜生长，提取质粒，BamHI和EcoRI双酶切鉴定，并且核苷酸测序证实。

1.2.4重组质粒转染NIH3T3细胞及阳性细胞克隆的筛选

在6孔板中接种NIH3T3细胞(每毫升2×105个细胞)，37℃、5％C02的培养箱中培养18～24h，待细胞生长至90％－95％满时分别用重组质粒(pcDNA3.1(－).sTNFRl)和空质粒(pcDNA3.1(－))进行转染，并设阴性对照(仅有培基，不加质粒DNA)，具体操作按脂质体Lipofac－tamine2000说明书进行，转染后96h，改用选择性培基(G418浓度前两天为250mg/L，后为500mg/L)，隔日换液，一共选择培养16d，至阴性对照孔细胞全部死亡，后降G418浓度为250mg/L，第18d后陆续挑取6个单克隆细胞(分别编号为N1－6)扩大培养．建立稳定传代的转染细胞株pcDNA3.1(-)-sTNFR1/NIH3T3(PSR/NIH3T3)。

1.2.5重组质粒转染NIH3T3细胞及阳性细胞克隆的鉴定

1)对PSR/NIH3T36个细胞系进行RT-PCR分析，pcDNA3.1(－)/NIH3T3(P/NIH3T3)和NIH3T3作对照，筛选sTNFR1mRNA有表达的真性克隆，细胞RNA的提取步骤同上，在紫外分光光度仪上检测RNA的质量及浓度后进行RT-PCR，取总RNA3μg，Oligo(18)0.5μg，加DEPC水至总体积12μL，70℃5min后，立即置于冰上；然后加入5×RTBuffer5μL，dNTP312.5

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nmol，RNA酶抑制剂25U，MMLV逆转录酶200U，加DEPC水至总体积25μL，42℃60min逆转录；逆转录后产物为cDNA，取cDNA2μL，加入10×PCRBuffer5μL，dNTP320nmol，sTNFR1上游及下游引物各50pmol，GAPDH上游及下游引物各50pmol，TaqDNA聚合酶3U，加双蒸水至总体积50μL。置PCR仪中，循环温度及时间为：95℃5min；随后以3步循环(94℃40s，55℃40s，72℃1min)扩增DNA，共32个循环；最后72℃10min延伸，反应结束后取PCR产物8μL，1.2％琼脂糖凝胶电泳照相。

2)对RT-PCR鉴定的5个单克隆细胞株取其中1株作Western-blotting鉴定，并以P/NIH3T3和NIH3T3作对照：将100mL培养瓶中的细胞，用冰预冷PBS洗一次，加入1mL裂解缓冲液，冰浴20min，用细胞刮刮下细胞，将裂解缓冲液及细胞碎片吸入一预冷的EP管中；4℃下10000r/min，离心2min；将上清液吸人一新EP管，保存于－70℃二将蛋白与加样缓冲液1:1比例混合，100℃煮沸5min；10000r/min离心5min；上清用于加样。

将收集的上清液进行SDS-PAGE电泳分离后，将细胞蛋白转移到PVDF膜上，100V、4℃转移电泳70min，转膜完毕经丽春红染色可见有目的蛋白条带，TBS洗涤两次，用含5％脱脂奶粉的TBST37℃封闭1h，将PVDF膜与兔抗人sTNFR1多克隆抗体(浓度0.1mg/L)温育2h，TBST洗涤5minx3后。与HRP标记的羊抗兔IgG(1:3000)室温孵育1h，TBS洗涤10min×3，0.1mL/em2量加ECL发光试剂，暗室内曝光X光胶片，常规方法显影、定影。

2结果

2.1sTNFR1基因片段的扩增及纯化

经扩增的sTNFR1的基因片段的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳可见558bp大小的DNA条带(图1)。

2.2T载体克隆的构建

将纯化的PCR产物与T载体连接后转入感受态大肠杆菌JM109，以对目的片段大量扩增，经对阳性克隆质粒提取及酶切鉴定，证实成功构建T载体克隆(图2)。

2.3sTNFR1基因真核表达的亚克隆

将酶切、纯化后的目的片段与表达载体pcD―NA3.1(-)连接，转化入感受态细菌JM109，获得含peDNA3.1(-)-sTNFR1重组表达质粒基因工程菌，并经酶切(图3)及核苷酸测序证实(图4)。

2.4sTNFR1的稳定转染细胞株的鉴定

1)RT-PCR检测sTNFR1mRNA的表达

扩增培养单克隆细胞，提取细胞总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳及紫外扫描两种方法检测示RNA抽提质量较好(图5)，RT-PCR的结果表明PSR/NIH3T3、P/NIH3T3、NIH3T3细胞中均不同程度地扩增出sTNFR1的mRNA.经扩增产物密度半定量检测有5株PSR/NIH3T3的sTNFR1为高水平表达(表1、图6)。

2)Western-blotting检测sTNFR1高表达细胞株

PSR/NIH3T3单克隆株N1、P/NIH3T3细胞株和NIH3T3细胞株均在30kD处有sTNFR1蛋白表达，以β-actin为内参照，PSR/NIH3T3单克隆株N1蛋白质表达强度明显高于P/NIH3T3细胞株和NIH3T3细胞株(图7)，经Western-blotting鉴定，PSR/NIH3T3单克隆株N1为稳定转染细胞株。

3讨论

肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor，TNFα)是由激活的单核巨噬细胞分泌的，具有多种生物学效应的细胞因子，它的生物学功能是通过与细胞表面TNFα受体的结合来实现的，TNFα受体有两种――TNFR1(55kD)和TNFR2(75kD)，均为糖蛋白，其中TNFR1介导了大部分TNFa的生物学功能，如抗病毒、诱导凋亡，活化NFKB，成纤维细胞增殖等，TNFR的两种受体(TNFR1和TNFR2)均可分两种类型，膜结合型(mTNFR)和可溶型(sTNFR)，可溶性受体为膜结合型受体胞外区在TNF转换酶(TACE)的作用下从细胞膜上解离下来，游离在血液中，仍可与TNFa结合，但无法介导TNFa的信号传导，因此，sTNFR能竞争性地与TNF分子结合，形成可溶性TNF-sTNFR复合物，间接抑制TNFa的生理作用，有研究表明，体内TNFα的过度表达在多种疾病的发生发展病理过程中发挥着重要作用，如：败血症休克、暴发性肝炎、类风湿性关节炎和移植后排斥反应等，因此，应用sTNFR1抑制TNFa的生理作用，以治疗TNFa介导的疾病有着重要的意义，尽管sTNFR1属内源性物质，但从体液中直接提取sTNFR1的量有限，难以满足临床治疗与诊断的需要，利用基因工程的方法生产sTNFR1有深远的研究和应用价值。

人sTNFR1是一种具有生物学活性的分泌性蛋白，国内高波等利用杆状病毒穿梭载体Bacmid转染sf21昆虫细胞，获得了高效表达，而我们将sTNFR1cDNA重组在真核表达载体pCDNA3.1(-)中，该载体在多克隆位点的上游及下游分别带有CMV的启动子和BGH的polyA尾，这种强有力的巨细胞病毒的增强启动子序列，能高效表达插入的目的基因，并且可在广泛的宿主细胞中工作，本研究从人Hela细胞提取总RNA，自行设计并合成sTNFR1两条引物，通过RT-PCR获得了的558bp大小的目的片段sTNFR1全编码的基因，构建了重组质粒pCDNA3.1(-)-sTNFR1亚克隆，经酶切及和核苷酸测序，证实获得pCDNA3.1(-).sTNFRl重组基因工程菌，将测序因子与Loetscher等报告的序列比较，结果完全一致，无移码突变，sTNFR1真核表达载体的构建为下一步基因转染，表达目的蛋白奠定了基础。

NIH3T3为小鼠成纤维细胞株，来源于Swiss小鼠胚胎，早在1962年建系，本研究之所以选用NIH3T3作为基因转导的载体细胞是因为成纤维细胞容易在体外培养及大量扩增，其回输的方法也及其简单，在动物实验中，可以直接注射入受体的腹腔或皮下，已有大量的将不同细胞因子基因转入成纤维细胞的报道，这些细胞因子在成纤维细胞中均能稳定的表达，在血友病的基因治疗中，Roth等用电穿孔法将FⅧ因子基因导入甲型血友病患者离体成纤维细胞，筛选出能分泌FⅧ蛋白的成纤维细胞，克隆扩增后注入患者腹腔，6例接受治疗的患者有4倍血浆FⅧ水平明显增高，出血症状改善并持续10个月之久，成功地采用成纤维细胞作为基因治疗的靶细胞用于治疗血友病，故本研究选取NIH3T3细胞系作稳定转染。

本研究选用Invitrogen公司的阳离子脂质体Lipofectamine2000，其转染条件稳定，转染效率高．我们根据产品说明书确定脂质体悬液用量为10μL，DNA用量为4μg，选定6/h为脂质体－DNA复合物和细胞的孵育时间，成功地将重组质粒转入NIH3T3细胞，并筛选出稳定表达的PSR/NIH3T3细胞系，在鉴定PSR/NIH3T3的实验过程中发现，不论是P/NIH3T3还是NIH3T3均有sTNFR1的表达，但PSR/NIH3T3细胞中的sTNFR1表达量，不论是mRNA水平还是蛋白表达水平均明显高于P/NIH3T3和NIH3T3，说明转入细胞内的基因能有效表达．PSR/NIH3T3稳定转染细胞系的建立为利用该细胞系进行基因治疗的实验研究打下了基础。